本文關鍵詞：抗中蜂囊狀幼蟲病毒VP2蛋白卵黃抗體制備及其間接ELISA檢測方法的建立

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【摘要】：目的利用生物信息學軟件對編碼中蜂囊狀幼蟲病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)結構蛋白VP2的密碼子進行優(yōu)化和原核表達,并用其制備卵黃抗體。同時利用純化VP2蛋白作為包被抗原建立檢測抗CSBV卵黃抗體的間接ELISA方法。方法通過對17株囊狀幼蟲病毒(SBV)和7株中蜂囊狀幼蟲病毒(CSBV)的VP2基因序列進行比對,選取代表毒株(Gen Bank:HM237361.1)CSBV-LN株VP2基因作為參考序列,并用在CSBV所有毒株中保守性相對較強的氨基酸替換CSBV-LN株VP2對應位置的氨基酸,通過在線軟件(http://www.jcat.de/和http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)對其密碼子進行優(yōu)化,構建原核表達質(zhì)粒p ET-28a-opti VP2,并轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)中,進行誘導表達。表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Westren blot鑒定正確后,將純化的表達蛋白免疫白來杭母雞,檢測免疫雞的抗體水平和淋巴細胞增值指數(shù)進行,分析CSBV VP2蛋白的免疫原性,同時收集免疫后雞蛋制備卵黃抗體,經(jīng)純化卵黃抗體與CSBV相互作用1 h后,接種于2-3日齡中華蜜蜂幼蟲,觀察幼蟲死亡率,研究卵黃抗體中和CSBV病毒能力。為了對制備的抗CSBV VP2卵黃抗體進行檢測,本研究以純化的VP2蛋白作為包被抗原,并通過對包被抗原濃度、卵黃抗體稀釋度、酶標二抗稀釋倍數(shù)、陰陽性臨界值的確定以及敏感性試驗、重復性試驗,建立檢測抗CSBV卵黃抗體的間接ELISA檢測方法。結果17株SBV分離株遺傳進化分析表明,SBV形成兩個分支,其中感染西方蜜蜂(Apis mellifera L)的SBV形成一個分支,而包括7株CSBV在內(nèi)的感染東方蜜蜂(Apis cerana F')的SBV形成另一個分支。7株CSBV的VP2氨基酸序列比對分析表明,不同毒株間氨基酸同源性介于94%-99.6%,其中CSBV-LN株(Gen Bank:HM237361)與各株間同源性相對較高(94.4%-99.6%),因此選擇CSBV-LN株的VP2基因序列為參考序列,同時用在CSBV所有毒株中保守性相對較強的氨基酸替換CSBV-LN株VP2對應位置的氨基酸,將CSBV-LN株VP2上的第49、84和148位上的天冬酰胺(N)、組氨酸(H)和纈氨酸(V)分別替換為絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)和異亮氨酸(I),進行密碼子優(yōu)化和原核表達。優(yōu)化后的opti VP2能夠在大腸桿菌中高效表達,其表達產(chǎn)物接種白來杭母雞可誘導其產(chǎn)生特異性抗CSBV抗體,且抗體水平明顯高于PBS組(P0.05);脾淋巴細胞增值指數(shù)的測定結果顯示VP2蛋白免疫組與純化病毒免疫組的SI值差異不顯著(P0.05),但與PBS組差異顯著(P0.05);中和試驗結果顯示,病毒接種量在小于等于1x107拷貝/只時制備的抗CSBV VP2卵黃抗體組和非免疫雞蛋提取的卵黃抗體組幼蟲死亡率差異顯著(P0.05),而與PBS組差異不顯著(P0.05)。同時確定ELISA方法抗原最適包被濃度為800 ng/孔,卵黃抗體的最佳稀釋度為1:100,酶標二抗最佳稀釋倍數(shù)為1:1000。在此基礎上,確定該ELISA方法陰陽性臨界值判定標準為1.2661,并表現(xiàn)出良好的敏感性和重復性。結論1、通過對密碼子的優(yōu)化實現(xiàn)了CSBV結構蛋白VP2在原核系統(tǒng)的高效表達。2、雞免疫實驗表明VP2蛋白具有良好免疫原性,而且用其制備的卵黃抗體,具有中和CSBV能力,為進一步開發(fā)防治CSBV的生物制劑奠定了基礎。3、利用純化CSBV VP2蛋白作為包被抗原建立了抗CSBV卵黃抗體間接ELISA檢測方法。
【學位授予單位】：錦州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S895

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本文編號：1279795