本文關(guān)鍵詞：miR-432-5p在徐淮山羊不同組織中的表達(dá)分析及功能研究

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【摘要】：micro RNAs(miRNAs)是一類高度保守的單鏈非編碼小RNA,長(zhǎng)度約為21~25nt,其本身不編碼蛋白,但可以通過(guò)靶向抑制或降解mRNA的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)生命活動(dòng)。miRNA在生物體內(nèi)廣泛分布,可以調(diào)控骨骼肌的增殖和分化。實(shí)驗(yàn)室前期山羊骨骼肌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明,miR-432-5p在山羊骨骼肌中表達(dá)豐度較高,推測(cè)其可能對(duì)骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育有調(diào)控作用。因此本實(shí)驗(yàn)選取miR-432-5p為研究對(duì)象,深入探究其對(duì)骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的影響,對(duì)miR-432-5p在徐淮山羊胎羊和成年羊2個(gè)發(fā)育時(shí)期,不同組織中的表達(dá)譜進(jìn)行分析;構(gòu)建miR-432-5p的過(guò)表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-miR-432-5p,將miR-432-5p過(guò)表達(dá)載體、miR-432-5p mimics、negative control(NC)、miR-432-5p inhibitors和anti-negative control(Anti-NC)分別轉(zhuǎn)染到C2C12細(xì)胞中,利用RT-qPCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖標(biāo)志基因和分化標(biāo)志基因的表達(dá)量,探究miR-432-5p對(duì)C2C12細(xì)胞增殖和分化的影響;使用預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)miR-432-5p的靶基因,從中篩選出4個(gè),構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告基因載體來(lái)驗(yàn)證其與miR-432-5p的靶向關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)主要結(jié)果如下:1.miR-432-5p在徐淮山羊不同發(fā)育時(shí)期、不同組織的表達(dá)譜分析分析miR-432-5p在徐淮山羊不同發(fā)育時(shí)期、不同組織中相對(duì)表達(dá)量可知,在胎羊個(gè)體中,miR-432-5p在腿肌中的相對(duì)表達(dá)量最高,其次是背最長(zhǎng)肌;而在成年羊個(gè)體中,心肌和腿肌是表達(dá)量最高的兩個(gè)組織;并且miR-432-5p在胎羊肌肉組織中的表達(dá)量顯著高于成年羊。表明miR-432-5p的表達(dá)不僅具有組織差異性,還有明顯的發(fā)育時(shí)期差異性。2.pcDNA3.1(+)-miR-432-5p的構(gòu)建與驗(yàn)證擴(kuò)增miR-432-5p前體序列,利用雙酶切法將其連接到質(zhì)粒pcDNA3.1上,將構(gòu)建好的過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)miR-432-5p的相對(duì)表達(dá)量,與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組中miR-432-5p的表達(dá)量顯著上調(diào)。結(jié)果表明,pcDNA3.1(+)-miR-432-5p載體可以在細(xì)胞中高效表達(dá),可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.miR-432-5p促進(jìn)C2C12細(xì)胞增殖RT-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在正常生長(zhǎng)狀態(tài)下,miR-432-5p和Ki67的表達(dá)量是隨著細(xì)胞增殖逐步上升的,推測(cè)miR-432-5p對(duì)C2C12細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用。為了驗(yàn)證這一推論,本實(shí)驗(yàn)將pcDNA3.1(+)-miR-432-5p、miR-432-5p mimics、negative control(NC)、miR-432-5p inhibitors、anti-negative control(Anti-NC)分別轉(zhuǎn)染到C2C12細(xì)胞中。結(jié)果發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)miR-432-5p后Ki67 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)都顯著上升,表明miR-432-5p促進(jìn)了Ki67基因的表達(dá);轉(zhuǎn)染miR-432-5p inhibitors抑制內(nèi)源性miR-432-5p的表達(dá)后發(fā)現(xiàn),細(xì)胞增殖標(biāo)志基因的K i67的表達(dá)量顯著下調(diào),表明miR-432-5p可以促進(jìn)C2C12細(xì)胞增殖。4.miR-432-5p抑制C2C12細(xì)胞分化將pcDNA3.1(+)-miR-432-5p、miR-432-5p mimics、negative control(NC)、miR-432-5p inhibitors和anti-negative control(Anti-NC)轉(zhuǎn)染到C2C12細(xì)胞中,用含2%馬血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)C2C12分化,用顯微鏡觀察不同處理情況下細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和形態(tài)的變化,提取細(xì)胞RNA和總蛋白,分別采用熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)細(xì)胞分化標(biāo)志基因MyoG、Myf5、Mef2c mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量。形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)第4 d,C2C12細(xì)胞有明顯的肌管形成;熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)miR-432-5p后細(xì)胞中分化標(biāo)志基因MyoG、Myf5、Mef2c mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量顯著下調(diào)。而轉(zhuǎn)染了miR-432-5p inhibitors后,MyoG、Myf5和Mef2c的表達(dá)量顯著上升,表明miR-432-5p抑制C2C12細(xì)胞分化。5.miR-432-5p靶基因預(yù)測(cè)及驗(yàn)證利用在線預(yù)測(cè)軟件Targetscan預(yù)測(cè)miR-432-5p靶基因,由于數(shù)據(jù)庫(kù)中還沒(méi)有山羊的序列,所以用近源物種牛的mRNA:miRNA互作關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè),再對(duì)預(yù)測(cè)得到的候選基因用DAVID在線軟件進(jìn)行基因注釋,篩選可能對(duì)肌肉細(xì)胞增殖發(fā)育有影響的基因作為進(jìn)一步研究對(duì)象。初步篩選了4個(gè)靶基因:SORT1、TGFBR2、GJC1、BCL2。構(gòu)建這4個(gè)潛在靶基因的野生型和突變型雙熒光素酶報(bào)告基因載體,分別與miR-432-5p mimics共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中,根據(jù)熒光值的變化,鑒定SORT1、TGFBR2是miR-432-5p的靶基因。為了進(jìn)一步驗(yàn)證SORT1、TGFBR2基因miR-432-5p的靶向關(guān)系,將miR-432-5p mimics、negative control(NC)分別轉(zhuǎn)染至C2C12細(xì)胞中,western blot結(jié)果同樣表明SORT1、TGFBR2是miR-432-5p的靶基因。
【學(xué)位授予單位】：江蘇師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S827;Q78

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