本文關(guān)鍵詞：鵝TLR7和TLR21的分子克隆、生物信息學(xué)分析及其免疫學(xué)特性研究

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【摘要】：Toll樣受體是機體內(nèi)一類重要的病原識別受體,能對入侵機體的病原微生物進(jìn)行及時的識別,從而啟動機體固有免疫應(yīng)答并影響適應(yīng)性免疫的產(chǎn)生。本研究首次克隆并報道了四川白鵝Toll樣受體家族的TLR7和TLR21的cDNA序列,并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。鵝TLR7包含一個完整的開放閱讀框,編碼1045個氨基酸,其信號肽位于第1到27位,跨膜區(qū)位于第836位到860位,高度保守TIR結(jié)構(gòu)域位于第884位到1034位。鵝TLR21包含一個完整的開放閱讀框,編碼975個氨基酸,其信號肽位于第1到35位,跨膜區(qū)位于第757位到779位,高度保守TIR結(jié)構(gòu)域位于第809位到951位。比較兩基因在不同物種之間蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)物種之間親緣關(guān)系越接近比對相似性越高。為了得到TLR7和TLR21在鵝體各個組織的分布情況,我們利用半定量RT-PCR和定量RT-PCR方法構(gòu)建了組織表達(dá)譜。整個實驗過程中,選擇β-actin和GAPDH 作為內(nèi)參基因?qū)嶒灲Y(jié)果校正檢測。我們發(fā)現(xiàn)：TLR7的轉(zhuǎn)錄水平在雛鵝的法氏囊上最高,且在與免疫功能相關(guān)的組織如盲腸,哈德氏腺等也相對較高。值得注意的是,肺臟的相對表達(dá)量僅次于法氏囊,說明鵝TLR7與呼吸道疾病或許有緊密聯(lián)系。比較不同年齡鵝之間免疫組織表達(dá)譜后,我們發(fā)現(xiàn)無論是成年鵝,還是幼鵝,都在法氏囊和脾臟有穩(wěn)定的高表達(dá)。不同的是,幼鵝以法氏囊,胸腺為主要免疫器官,而或許是隨著發(fā)育進(jìn)行,成年鵝則是以外周血,法氏囊和脾臟為主要免疫器官。TLR21的轉(zhuǎn)錄水平在鵝的哈德氏腺,胸腺等免疫功能相關(guān)組織表達(dá)量高。比較不同年齡鵝之間全組織表達(dá)譜后,我們發(fā)現(xiàn)幼年鵝法氏囊表達(dá)最高,而成年鵝法氏囊卻只有中等的轉(zhuǎn)錄水平,這與TLR7的結(jié)果類似,說明鵝免疫分子的在組織中的表達(dá)量隨個體生長發(fā)育而有所變化�？傮w來講,TLR7和TLR21都在免疫組織器官中高表達(dá),這與它們發(fā)揮的免疫功能密切相關(guān)。不同發(fā)育階段鵝TLRs的組織表達(dá)差異,也說明了鵝免疫系統(tǒng)隨著發(fā)育而成熟。為了驗證鵝TLR7和TLR21的免疫學(xué)特性,我們選取了幾種免疫刺激劑：R848、Imiquimod、Poly(I:C)和ODN2006。這些刺激劑都是已知證實能被Toll樣受體識別,并引發(fā)固有免疫反應(yīng)。其中R848是TLR7和TLR8的刺激劑,Imiquimod是TLR7的刺激劑,Poly(I:C)是TLR3的刺激劑,而ODN2006則是TLR9和TLR21的刺激劑。通過這些刺激劑處理分離的鵝脾臟淋巴細(xì)胞和鵝外周血淋巴細(xì)胞,利用定量RT-PCR方法檢測TLR7和TLR21是否受刺激而表達(dá)上調(diào),同時檢測免疫通路下游的促炎性因子IL-6, IL-1β和干擾素IFN-a與IFN-y的表達(dá)情況。整個實驗過程中,選擇P-actin和GAPDH作為內(nèi)參基因?qū)嶒灲Y(jié)果校正檢測,并同時以PBS處理鵝脾臟淋巴細(xì)胞和鵝外周血淋巴細(xì)胞做陰性對照。我們發(fā)現(xiàn)：和預(yù)期一樣,R848和Imiquimod都能引起鵝TLR7的響應(yīng),同時TLR7介導(dǎo)固有免疫通路下游的IL-6, IL-1β和IFN-a也都有顯著的表達(dá)上調(diào)。ODN2006能夠有效的刺激鵝TLR21的表達(dá)并引發(fā)下游的IL-6,IL-1β, IFN-a和IFN-y的顯著上調(diào),而Poly(I:C)作為陽性對照,對TLR7和TLR21表達(dá)量無影響,但是上調(diào)IL-6和IFN-a的表達(dá),說明或許是鵝TLR3被刺激產(chǎn)生的免疫反應(yīng)�？傮w來說,這些刺激劑都能有效地引起鵝脾臟淋巴細(xì)胞和鵝外周血淋巴細(xì)胞的免疫反應(yīng),因此有作為新型鵝疾病防治免疫佐劑的可能。為了確認(rèn)鵝TLR7和TLR21參與宿主的抗病毒反應(yīng),我們選用新型雛鵝病毒性腸炎病毒(NGVEV)感染分離的鵝脾臟淋巴細(xì)胞和鵝外周血淋巴細(xì)胞,利用定量RT-PCR方法檢測TLR7和TLR21是否受刺激表達(dá)上調(diào),同時檢測免疫通路下游的促炎性因子IL-6, IL-1β和干擾素IFN-a與IFN-y的表達(dá)情況。整個實驗過程中,選擇β-actin和GAPDH作為內(nèi)參基因?qū)嶒灲Y(jié)果校正檢測,并同時以PBS處理鵝脾臟淋巴細(xì)胞和鵝外周血淋巴細(xì)胞做陰性對照。我們發(fā)現(xiàn)：在NGVEV感染之后,鵝TLR7在96h內(nèi)均無表達(dá)上調(diào),而鵝TLR21則能被刺激,并由此介導(dǎo)下游的IL-6, IL-1β, IFN-a和IFN-y的表達(dá)上調(diào)。因此,有效的刺激TLR21也許能成為預(yù)防NGVEV等病毒感染鵝體的方法,而ODN2006則具備了成為重要的抗病毒免疫效劑的可能。綜上,本研究豐富了鵝體內(nèi)抗病毒固有免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)知識,為進(jìn)一步深入揭示鵝抗病毒免疫反應(yīng)相關(guān)研究奠定基礎(chǔ),并為鵝疾病的防治提供參考。
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S835

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