本文關(guān)鍵詞：重組減毒沙門氏菌鴨瘟病毒DNA疫苗的構(gòu)建及其口服免疫效果研究

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【摘要】：本論文以質(zhì)粒pVAXl和pGL3-control為基礎(chǔ),輔以重要元件(CpG免疫基序、核靶向序列、asd基因等),利用類生物學(xué)合成方法構(gòu)建出一種新穎的通用型DNA疫苗載體,命名為pkDNA。酶切連接綠色熒光蛋白基因(egfP)'體外轉(zhuǎn)染COS-7細胞證實該質(zhì)粒具有pVAXl相似的真核表達能力。選取鴨瘟病毒gB糖蛋白膜外區(qū)域編碼基因和UL24基因為抗原基因,大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(E.coli LTB)基因和鴨IL-2mRNA反轉(zhuǎn)錄cDNA為分子佐劑構(gòu)建多種鴨瘟病毒DNA疫苗質(zhì)粒。以c8276 Acrp/cya(鼠傷寒沙門氏菌UK-1 △asd｛crp△cya缺失株)為口服免疫途徑遞送活菌載體,20日齡麻鴨口服免疫重組減毒沙門氏菌鴨瘟病毒DNA疫苗兩次,均能產(chǎn)生較高的體液及粘膜免疫應(yīng)答,并在一定程度上抵抗鴨瘟病強毒株的挑戰(zhàn),其中c8276△crp/cya (pkDNA-UL24-LTB)組效果顯著。結(jié)果如下：一種新穎通用型DNA疫苗載體的構(gòu)建：利用類生物學(xué)合成方法合成全新DNA疫苗載體pkDNA:以UK-1基因組、pVAX1和pGL3-control為模板PCR擴增獲得基因片段asd, pUC、CMVMCS、BGH　poly(A)、SV40 enhancer和SV40 late poly(A)片段：重疊PCR兩兩融合構(gòu)建三模塊片段：(1/2DTSII+asd/+CpG+PUC)、(BGH poly A+CpG+SV40 enhancer)和(MVMCS+CpG+SV40 polyA+1/2DTSII);最后利用Gibson Assembly(?) Master Mix(New England Biolabs(?)inc.)完成pkDNA質(zhì)粒的類生物合成。兩次測序結(jié)果表明與理論序列相符,酶切連接綠色熒光蛋白基因(egfp),直接熒光法可見綠色熒光蛋白在COS-7細胞中很好的表達,其真核表達能力與pVAX1相似。鴨瘟病毒DNA疫苗的構(gòu)建及其體外表達能力檢測：PCR擴增tgB(451-1650bp)、 UL24、LTB、和鴨IL-2基因；重疊PCR擴增得到UL24-LTB. UL24-DuIL2融合片段。單抗原基因及融合基因酶切連接pkDNA,完成鴨瘟病毒DNA疫苗質(zhì)粒:pkDNA-tgB、 pkDNA-UL24、pkDNA-UL24-LTB、pkDAN-UL24-DuIL2,測序鑒定無誤。所有DNA疫苗質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染COS-7細胞,間接免疫熒光檢測轉(zhuǎn)染24小時后的細胞,均可見強烈的綠色熒光信號,而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組及空白組熒光不明顯；48小時后,收集細胞,提取總RNA, RT-PCR檢測可見pkDNA-UL24-LTB和pkDNA-UL24-DuIL2轉(zhuǎn)染組中佐劑基因特異性轉(zhuǎn)錄。c$276△crp/cya弱毒株及重組減毒沙門氏菌鴨瘟病毒DNA疫苗菌株的構(gòu)建：以鼠傷寒沙門氏菌c8276(UK-1△ash/)△crp缺失株為親本構(gòu)建c8276 △crp/cya弱毒株,經(jīng)PCR及麥康凱(麥芽糖+)平板鑒定表明突變株構(gòu)建成功。鴨瘟病毒DNA疫苗質(zhì)粒電轉(zhuǎn)c82776△crp/cya,獲得系列重組沙門氏菌鴨瘟病毒DNA疫苗菌株：c8276△crp/cya (pkDNA-tgB)、c8276△crp/cya(pkDNA-UL24)、c8216△crp/cya (pkDNA-UL24-LTB)、 c8276｛crp/cya(pkDAN-UL24-DuIL2), c8276△crp/cya(pVAXl-UL24)及 c8276△crp/cya (pkDNA);LB平板上連續(xù)劃線培養(yǎng)20代,PCR鑒定顯示DNA疫苗質(zhì)粒在c8276Acrp/cya中遺傳穩(wěn)定性良好,且不影響菌株生長；7日齡麻鴨口服接種高達1012CFUc8276Acrp/cya(pkDNA),兩周內(nèi)小鴨食欲飲欲正常,剖檢各器官組織無任何病癥現(xiàn)象,重組疫苗安全性良好。重組減毒沙門氏菌鴨瘟病毒DNA疫苗免疫效果研究：20日齡麻鴨隨機分成7組,記為A-G:A.c8276△crp/cya(pkDNA-UL24)、B.c8276△crp/cya(pkDNA-UL24-LTB)、 C.c8276△crp/cya(pkDAN-UL24-DuIL2)、D.c8276△crp/cya(pkDNA-tgB)+c8276△crp/cya (pkDNA-UL24)、E.c8276△crp/cya(pVAX1-UL24)、F.c8276Acrp/cya(pkDNA)及G.BSG組,每組15只,每只口服免疫1012CFU重組疫苗菌株,共免疫兩次,每次間隔2周。一免后第10天、21天和28天每組隨機挑選6只采集血清,一免后第21天,每組隨機選取5只采集膽汁及十二指腸粘液,分別檢測針對tUL24蛋白及DEV病毒顆粒的抗體應(yīng)答水平,二免兩周后DEV強毒株CHv經(jīng)口攻毒檢測疫苗保護力水平。結(jié)果顯示：B組誘導(dǎo)最高的膽汁IgA抗體水平(P0.05),B組和C組產(chǎn)生的血清IgY抗體水平高于其他組(P0.05),D組麻鴨產(chǎn)生更高的抗DEV的抗體水平比起抗tUL24；所有實驗組(A-D)和陽性對照E組產(chǎn)生的抗體水平顯著性高于F和G組(P0.01)；攻毒12天后B組存活率最高(9/10),D組隨之7/10,C與E組相同6/10,A組偏低僅5/10,均明顯高于F(2/10)和G組(0)。
【關(guān)鍵詞】：DNA疫苗載體 鴨瘟病毒DNA疫苗 減毒沙門氏菌 重組疫苗 口服免疫
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.4
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-12
• 第一章 減毒沙門氏菌遞送鴨瘟DNA疫苗的研究進展12-24
• 1 減毒沙門氏菌用于DNA疫苗遞送12-14
• 1.1 沙門氏菌與宿主細胞的相互作用12-13
• 1.2 減毒沙門氏菌作為疫苗載體13
• 1.3 減毒沙門氏菌用于DNA疫苗遞送的優(yōu)勢及研究進展13-14
• 2 DNA疫苗的研究進展14-20
• 2.1 DNA疫苗概述15
• 2.2 增強DNA疫苗效力的方法15-19
• 2.3 DNA疫苗口服免疫途徑的應(yīng)用19-20
• 3 鴨瘟概述20-22
• 3.1 鴨瘟概述20
• 3.2 鴨瘟病毒免疫原性特征20-21
• 3.3 鴨瘟病毒DNA疫苗的研究現(xiàn)狀21-22
• 4 選題目的和意義22-24
• 第二章 新穎通用型DNA疫苗載體的構(gòu)建及其真核表達能力的研究24-37
• 1 材料24-25
• 1.1 主要質(zhì)粒、菌株、細胞及試劑24-25
• 1.2 主要的儀器設(shè)備25
• 2 方法25-29
• 2.1 單元基因引物設(shè)計25-26
• 2.2 單元基因片段擴增26-27
• 2.3 (1/2DTSⅡ+asd+CpG+pUC),(BGH late poly A+CpG+SV40 enhancer)和(CMVMCS+CpG+SV40late poly A+1/2DTSⅡ)模板片段的構(gòu)建27-28
• 2.4 類生物合成新穎通用型DNA疫苗載體pkDNA28
• 2.5 pkDNA載體質(zhì)粒的酶切及測序鑒定28
• 2.6 pkDNA-egfp質(zhì)粒的構(gòu)建28-29
• 2.7 熒光顯微鏡觀察pkDNA-egfp質(zhì)粒在COS-7中的表達29
• 3 結(jié)果29-34
• 3.1 單片段的PCR擴增結(jié)果29-30
• 3.2 三模板片段的融合PCR結(jié)果30-31
• 3.3 pkDNA質(zhì)粒的合成及PCR鑒定31
• 3.4 pkDNA測序結(jié)果31-32
• 3.5 pkDNA-egfp質(zhì)粒的構(gòu)建32-33
• 3.6 熒光顯微鏡觀察pkDNA-egfp質(zhì)粒在COS-7中的表達結(jié)果33-34
• 4 討論34-36
• 4.1 平衡致死質(zhì)粒宿主系統(tǒng)作為質(zhì)粒篩選的優(yōu)勢34
• 4.2 CpG基序作為DNA疫苗佐劑的優(yōu)勢34-35
• 4.3 核靶向序列(nuclear targeting sequences,DTS)對抗原表達量的影響35
• 4.4 多聚腺苷酸的作用35
• 4.5 類生物合成法構(gòu)建質(zhì)粒的優(yōu)勢35-36
• 5 小結(jié)36-37
• 第三章 鴨瘟DNA疫苗質(zhì)粒的構(gòu)建及體外表達能力檢測37-50
• 1 材料37-38
• 1.1 質(zhì)粒、病毒、菌株及細胞37
• 1.2 主要試劑37
• 1.3 主要的儀器設(shè)備37-38
• 2 方法38-42
• 2.1 抗原基因UL24、tgB(451-1670bp)及佐劑基因LTB、DuIL2的PCR擴增38-39
• 2.2 重疊PCR構(gòu)建UL24-LTB、UL24-DuIL2融合基因39
• 2.3 單抗原基因及抗原與佐劑的融合基因酶切連接pkDNA疫苗載體及鑒定39
• 2.4 tUL24蛋白及tgB截斷蛋白的原核表達及純化39-40
• 2.5 兔抗tgB及tUL24截斷蛋白血清的制備40
• 2.6 鴨瘟DNA疫苗質(zhì)粒的體外表達能力檢測40-42
• 3 結(jié)果42-47
• 3.1 抗原基因UL24、tgB及佐劑基因LTB、Du1L2的PCR擴增結(jié)果42
• 3.2 重疊PCR構(gòu)建UL24-LTB和UL24-Du1L2融合基因結(jié)果42-43
• 3.3 鴨瘟DNA疫苗的測序結(jié)果43
• 3.4 截斷蛋白tgB(451-1650bp)及tUL24(720-1230bp)的原核表達及純化43-45
• 3.5 瓊脂糖擴散實驗驗證兔抗tgB和tUL24血清效價45
• 3.6 間接免疫熒光檢測鴨瘟DNA疫苗質(zhì)粒在COS-7細胞中的表達結(jié)果45-47
• 3.7 RT-PCR檢測鴨瘟DNA疫苗質(zhì)粒在COS-7細胞中的表達結(jié)果47
• 4 討論47-48
• 4.1 外源囊膜糖蛋白對細菌生理特征的影響47-48
• 4.2 從蛋白及基因水平來檢測鴨瘟DNA疫苗在體外細胞內(nèi)的表達48
• 5 小結(jié)48-50
• 第四章 弱毒沙門氏菌c8276△crp/cya的構(gòu)建及以此為基礎(chǔ)的重組減毒沙門氏菌鴨瘟病毒DNA疫苗的構(gòu)建及鑒定50-60
• 1 材料50-51
• 1.1 主要質(zhì)粒、菌株及試劑50
• 1.2 主要的儀器設(shè)備50-51
• 2 方法51-54
• 2.1 cya上下游基因的擴增51
• 2.2 cya上下游同源臂的融合51
• 2.3 cya上下游融合基因酶切連接pRE112質(zhì)粒及鑒定51-52
• 2.4 質(zhì)粒pRE112-△cya轉(zhuǎn)染供體菌株52
• 2.5 在減毒鼠傷寒沙門氏菌c8276△crp基礎(chǔ)上構(gòu)建c8276△crp/cya52
• 2.6 缺失株c8276△crp/cya的生化鑒定52-53
• 2.7 鴨瘟DNA疫苗質(zhì)粒電轉(zhuǎn)c8276△crp/cya感受態(tài)53
• 2.8 鴨瘟DNA疫苗質(zhì)粒在c8276△crp/cya中的穩(wěn)定性鑒定53
• 2.9 重組減毒鼠傷寒沙門氏菌c8276△crp/cya鴨瘟DNA疫苗的安全性鑒定53-54
• 3 結(jié)果54-57
• 3.1 cya上下游基因的擴增及融合結(jié)果54
• 3.2 pRE112-△cya質(zhì)粒的鑒定54-55
• 3.3 c8276△crp菌株與c7213(pRE112-△cy)結(jié)合單菌落PCR鑒定55
• 3.4 c8276△crp/cya的鑒定55-56
• 3.5 鴨瘟DNA疫苗質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入c8276△crp/cya的PCR鑒定結(jié)果56
• 3.6 鴨瘟DNA疫苗質(zhì)粒在c8276△crp/cya中的穩(wěn)定性鑒定結(jié)果56
• 3.7 重組減毒鼠傷寒沙門氏菌c8276△crp/cya鴨瘟DNA疫苗的安全性鑒定結(jié)果56-57
• 4 討論57-59
• 4.1 自殺質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組方法構(gòu)建突變株57
• 4.2 鼠傷寒沙門氏菌△crp/cya雙缺失株作為疫苗載體的應(yīng)用57-58
• 4.3 pkDNA質(zhì)粒對c8276△crp/cya的生理特性的影響58
• 4.4 重組減毒鼠傷寒沙門氏菌c8276△crp/cya鴨瘟DNA疫苗的穩(wěn)定性及安全性評價的意思58-59
• 5 小結(jié)59-60
• 第五章 麻鴨口服免疫重組c8276△crp/cya DEV-DNA疫苗的免疫效果研究60-74
• 1 材料60-61
• 1.1 實驗動物60
• 1.2 菌株及病毒60
• 1.3 主要試劑及配制60
• 1.4 主要的儀器設(shè)備60-61
• 2 方法61-62
• 2.1 重組減毒鼠傷寒沙門氏菌c8276△crp/cya鴨瘟DNA疫苗口服劑量的確定61
• 2.2 動物免疫及樣品采集61
• 2.3 差速離心配合蔗糖墊底的方法純化DEV病毒顆粒61
• 2.4 包被抗原及陽性樣品最佳稀釋度的確定61-62
• 2.5 ELISA檢測特異性抗tUL24蛋白及DEV的抗體水平應(yīng)答62
• 2.6 攻毒保護試驗62
• 3 結(jié)果62-69
• 3.1 重組減毒鼠傷寒沙門氏菌c8276△crp/cya鴨瘟DNA疫苗的口服免疫62-63
• 3.2 鴨瘟病毒的細胞培養(yǎng)及純化63-64
• 3.3 最佳抗原及最佳樣品稀釋度的確定64-65
• 3.4 間接ELISA檢測血清抗tUL24蛋白和DEV的IgY滴度65-66
• 3.5 間接ELISA檢測膽汁中抗tUL24蛋白和DEV的IgA滴度66-69
• 4 討論69-72
• 4.1 檢測特異性IgY和IgA抗體的意義69
• 4.2 佐劑及多抗原基因同時免疫對鴨瘟DNA疫苗體液免疫的影響69-70
• 4.3 質(zhì)粒載體對鴨瘟DNA疫苗體液免疫的影響70-71
• 4.4 LTB作為黏膜佐劑在促進口服鴨瘟DNA疫苗免疫效果上的優(yōu)勢71-72
• 4.5 多抗原基因共免疫在誘導(dǎo)保護力上的優(yōu)勢72
• 5 小結(jié)72-74
• 參考文獻74-84
• 附錄 PKDNA全序列84-86
• 致謝86

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中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 劉雪燕;重組減毒沙門氏菌鴨瘟病毒DNA疫苗的構(gòu)建及其口服免疫效果研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

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本文編號：1031770