發(fā)布時間：2017-10-09 12:02

  本文關(guān)鍵詞：兔MSTN, Ankrd2對骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化影響及PGAM2,XKR4基因與家兔生長性狀關(guān)聯(lián)分析

  更多相關(guān)文章： 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞 基因沉默 細(xì)胞增殖分化 生長性狀 關(guān)聯(lián)性分析

【摘要】：肌肉生成抑制素(MSTN)基因是控制肌肉生長發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子,調(diào)節(jié)著畜禽產(chǎn)肉量,同時還發(fā)現(xiàn)其對成肌細(xì)胞分化為肌管的過程產(chǎn)生抑制作用；骨骼肌錨定重復(fù)蛋白2(Ankrd2)為骨骼肌中特異性表達(dá)的基因,參與到細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控以及控制著肌肉生長、肥大過程,在骨骼肌生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。本研究選取出生后1d的新西蘭幼兔為實驗材料,分離、純化家兔骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(Skeletal muscle satellite cells, SCs),采用siRNA介導(dǎo)的MSTN和Anrkd2基因沉默表達(dá),研究其在家兔SCs增殖和分化過程中發(fā)揮的作用。磷酸甘油酸變位酶(PGAM2)是糖酵解和糖異生的關(guān)鍵酶,在調(diào)節(jié)能量代謝活動和動物生長發(fā)育中起著重要作用。XKR4基因(Kell血型復(fù)合物的亞單元相關(guān)家組成員4)在生物體內(nèi)參與多種生物學(xué)過程,被認(rèn)為是影響動物采食量、脂肪沉積、生長速度的重要候選基因。本試驗選取天府黑兔、伊拉兔、香檳兔和新西蘭兔為試驗材料,檢測PGAM2和XKR4基因CDS區(qū)遺傳變異,采用PCR-RFLP和HRM技術(shù)對突變位點進(jìn)行分析,并將遺傳變異與家兔部分生長性狀進(jìn)行相關(guān)性分析。主要結(jié)果如下：(1)取出生1d的新西蘭白兔后腿肌肉組織,采用酶消化法分離、提取,差速貼壁法純化兔骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(SCs)。通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞表面標(biāo)志物檢查相結(jié)合對細(xì)胞進(jìn)行鑒定。將分離的細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),在各個培養(yǎng)階段,細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化均符合衛(wèi)星細(xì)胞各階段特征；選取傳至第二代的細(xì)胞,通過免疫組化檢測SCs標(biāo)志物Desmin蛋白,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中Desmin呈陽性表達(dá)。這些結(jié)果表明本試驗所分離、純化得到的細(xì)胞為骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。(2)針對MSTN和Anrkd2基因,分別采用特異的siRNA序列si-MSTN-01、 si-MSTN-02、si-MSTN-03和si-Ankrd2-01、si-Ankrd2-02、si-Ankrd2-03轉(zhuǎn)染至第二代的SCs,通過實時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染組和對照組在轉(zhuǎn)染24、48和72h后MSTN和Ankrd2基因mRNA的相對表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有的細(xì)胞在轉(zhuǎn)染siRNA 48h后對靶基因沉默效率均高于24h和72h。 si-MSTN-02轉(zhuǎn)染48h為最佳序列和時間組合,對MSTN沉默效率最高,約為66%; si-Ankrd2-01轉(zhuǎn)染48h為最佳序列時間組合,對Ankrd2沉默效率最高,約為69%。(3)選取培養(yǎng)傳代至第二代的兔SCs進(jìn)行轉(zhuǎn)染實驗,選用Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒通過酶標(biāo)儀分別檢測其在轉(zhuǎn)染si-MSTN-02 48h和si-Ankrd2-01 48h對細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果MSTN基因被抑制表達(dá)后,顯著性促進(jìn)了細(xì)胞的增殖能力(P0.05),Ankrd2基因被抑制表達(dá)后,極顯著促進(jìn)了細(xì)胞的增殖能力(P0.01)。表明MSTN和Anrkd2基因參與到調(diào)控細(xì)胞的增殖過程,并起到抑制作用。(4)采用實時熒光定量PCR的方法,檢測SCs分化標(biāo)志物myoD和Caveolin-3基因mRNA表達(dá)情況,結(jié)果顯示,傳至第二代的兔SCs,采用si-MSTN-02轉(zhuǎn)染48h后,MyoD、Caveolin-3表達(dá)量顯著性上升；采用si-Ankrd2-01轉(zhuǎn)染48h后,MyoD, Caveolin-3表達(dá)量也有明顯提高。結(jié)果MSTN, Ankrd2基因抑制表達(dá)后細(xì)胞分化為肌管的能力增強(qiáng),表明MSTN和Ankrd2基因?qū)」芊只^程起到抑制作用。(5)在PGAM2基因CDS區(qū)內(nèi)共檢測到3個SNPs,分別為：c.-10CT,c.195CT和c.414+17CT。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)位于外顯子2內(nèi)的c.195CT屬于同義突變,對該位點采用PCR-RFLP的技術(shù)進(jìn)行基因型分型并與生長性狀及部分屠宰性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：PGAM2基因c.195CT位點CT基因型與家兔84日齡體重(W84)顯著性相關(guān)(P0.05),與35到84日齡平均日增重(ADG)極顯著相關(guān)(P0.01)。(6)在XKR4基因CDS區(qū)內(nèi)共檢測到3個SNP位點,分別為：c.804-8CT,c.1668CT和c.1698CT,位于編碼區(qū)的兩個SNP位點(c.1668CT和c.1698CT)均未引起氨基酸改變,屬于同義突變,選取小樣本直接測序發(fā)現(xiàn)二者完全連鎖,對其采用HRM技術(shù)進(jìn)行基因型分型并與生長性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：XKR4基因c.1668CT和c.1698CT位點與70日齡體重(W70)顯著性相關(guān)(P0.05),與35到70日齡平均日增重(ADG)極顯著相關(guān)(P0.05)。本試驗通過對MSTN和Ankrd2基因沉默表達(dá)的研究,發(fā)現(xiàn)MSTN和Ankrd2基因會抑制SCs的增殖、分化,這為進(jìn)一步研究MSTN和Ankrd2基因在骨骼肌細(xì)胞生長發(fā)育方面的作用提供參考。家兔PGAM2和XKR4基因CDS區(qū)的SNPs與生長速度相關(guān),PGAM2和XKR4基因可作為影響家兔生長性狀的重要候選基因,為采用分子育種提高家兔生產(chǎn)性能提供理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞 基因沉默 細(xì)胞增殖分化 生長性狀 關(guān)聯(lián)性分析
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S829.1
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 1 文獻(xiàn)綜述12-26
• 1.1 概述12
• 1.2 動物骨骼肌生長發(fā)育12-15
• 1.2.1 肌肉組成及其發(fā)育特征12-13
• 1.2.2 肌纖維的類型及其之間的相互轉(zhuǎn)化13-14
• 1.2.3 肌纖維類型與肉質(zhì)的關(guān)系14-15
• 1.3 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞15-19
• 1.3.1 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞簡介15-16
• 1.3.2 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離方法16-18
• 1.3.3 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞鑒定18-19
• 1.4 骨骼肌生長發(fā)育過程中的重要轉(zhuǎn)錄因子19-23
• 1.4.1 MRFs家族19-21
• 1.4.2 肌肉生成抑制素21
• 1.4.3 肌錨定重復(fù)蛋白家族21-23
• 1.5 PGAM2基因23-24
• 1.6 XKR4基因24-25
• 1.7 研究目的及主要試驗內(nèi)容25-26
• 1.7.1 本試驗?zāi)康囊饬x25-26
• 1.7.2 本試驗主要內(nèi)容26
• 2 試驗材料與方法26-44
• 2.1 試驗材料26-31
• 2.1.1 試驗動物選擇與組織采集26-27
• 2.1.2 主要設(shè)備及器材27-28
• 2.1.3 主要試劑及配制28-30
• 2.1.4 主要器械消毒及清洗處理30-31
• 2.2 試驗方法31-44
• 2.2.1 新西蘭兔SCs分離、純化及培養(yǎng)31-34
• 2.2.2 siRNA合成及轉(zhuǎn)染細(xì)胞34-40
• 2.2.3 基因組DNA提取及純度檢測40-42
• 2.2.4 PGAM2,XKR4基因變異位點檢測42-44
• 2.2.5 PGAM2,XKR4基因靶SNPs位點與生長性狀關(guān)聯(lián)性分析44
• 3 試驗結(jié)果與分析44-58
• 3.1 MSTN,Ankrd2對兔骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化影響44-52
• 3.1.1 兔SCs的提取、純化及培養(yǎng)44-45
• 3.1.2 兔SCs鑒定45-47
• 3.1.3 熒光定量PCR篩選干擾率最高的siRNA序列47-49
• 3.1.4 轉(zhuǎn)染siRNA后SCs的增殖能力檢測結(jié)果49-50
• 3.1.5 轉(zhuǎn)染后SCs的分化能力檢測結(jié)果50-52
• 3.2 PGAM2,XKR4遺傳多態(tài)性及其與家兔生長性能的關(guān)聯(lián)分析52-58
• 3.2.1 耳組織基因組DNA提取52
• 3.2.2 家兔PGAM2基因遺傳多態(tài)性52-55
• 3.2.3 家兔XKR4基因遺傳多態(tài)性55-58
• 4 討論58-61
• 4.1 兔SCs細(xì)胞分離培養(yǎng)及純度鑒定58-59
• 4.2 MSTN,Ankrd2對兔SCs增殖分化的影響59-60
• 4.3 PGAM2基因與家兔生長性狀相關(guān)性60
• 4.4 XKR4基因與家兔生長性狀相關(guān)性60-61
• 5 結(jié)論61-62
• 參考文獻(xiàn)62-68
• 致謝68-69
• 攻讀碩士期間發(fā)表文章情況69

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 何波;鄭嶸;熊遠(yuǎn)著;胡春艷;;新生豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的培養(yǎng)鑒定及生物學(xué)特性[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報;2006年06期

2 趙燕;管武太;;大鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞體外原代培養(yǎng)的試驗研究[J];山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2007年03期

3 張晨暉;朱道立;;大鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)的研究[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2008年12期

4 鄭素月;樊寶良;張慶橋;;蛋雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定[J];中國畜牧獸醫(yī);2011年02期

5 單艷菊;束婧婷;宋遲;胡艷;朱春紅;李慧芳;;鴨骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定[J];江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué);2012年12期

6 李沖;劉娣;丁大有;毛冠平;周佳勃;;豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞體外培養(yǎng)[J];吉林農(nóng)業(yè)科學(xué);2007年04期

7 李方華;龐全海;侯玲玲;鄭揚;關(guān)偉軍;馬月輝;;骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞生物學(xué)特性及臨床應(yīng)用前景[J];生物技術(shù)通報;2009年10期

8 高琦;何鑫淼;管艷慧;劉娣;;豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞體外培養(yǎng)體系的建立[J];江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué);2006年01期

9 蔣守群;蔣宗勇;鄭春田;馬現(xiàn)永;席鵬彬;;金雀異黃酮對雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞脂質(zhì)過氧化和抗氧化酶活性的影響[J];中國畜牧雜志;2009年01期

10 梁青;董恩妮;張紅平;;骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞體外培養(yǎng)方法與技術(shù)[J];中國畜牧雜志;2014年01期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 覃立立;黎小葵;王，

本文編號：1000062