發(fā)布時間：2017-10-08 14:23

  本文關(guān)鍵詞：MiR29在鋁致腦內(nèi)Aβ沉積過程中的作用

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【摘要】：目的：1、通過動物體內(nèi)實驗,研究鋁對大鼠腦內(nèi)mi R29各亞型,BACE基因、蛋白及Aβ1-40和Aβ1-42的影響情況,篩選和分辨可能參與鋁致腦內(nèi)Aβ沉積過程的mi R29類型;2、通過細胞培養(yǎng),確定mi R29通過影響B(tài)ACE水平在鋁引起腦內(nèi)Aβ沉積過程中的作用機制;3、通過動物體內(nèi)實驗和細胞培養(yǎng)干預(yù)實驗,探索mi R29調(diào)節(jié)鋁致腦內(nèi)Aβ沉積過程的上游機制。方法：1、取40只健康的,雄性的SD大鼠,按體重隨機分為4組,生理鹽水組(對照組),15μmol/kg BW組(低劑量組),30μmol/kg BW組(中劑量組)和45μmol/kg BW組(高劑量組),每組10只。采用腹腔注射的方式進行染毒兩個月。染毒期結(jié)束后,采用石墨爐原子吸收法檢測大鼠血鋁、腦皮質(zhì)和海馬內(nèi)鋁含量;采用ELISA檢測大鼠皮質(zhì)和海馬Aβ1-40,Aβ1-42的量;采用RT-PCR檢測大鼠腦皮質(zhì)和海馬BACEm RNA,mi R29a,mi R29a*,mi R29b1,mi R29b2,mi R29c1,mi R29c2的表達水平;Western-blot檢測大鼠腦皮質(zhì)和海馬中BACE蛋白,NF-κB的表達激活情況。并分析各型mi R29與BACE的關(guān)系,從中篩選出可能參與調(diào)節(jié)鋁致腦內(nèi)Aβ沉積作用的mi R29的類型。2、選擇腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞系(PC12)細胞進行體外培養(yǎng),根據(jù)動物實驗結(jié)果,采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將mi R29a mimics或者mi R29b1 mimics轉(zhuǎn)染入細胞內(nèi),實驗組分別分為空白對照組,未轉(zhuǎn)染染毒組(包括100μmol/l麥芽酚鋁組,200μmol/l麥芽酚鋁組,400μmol/l麥芽酚鋁組),轉(zhuǎn)染陰性對照組和目的基因轉(zhuǎn)染組,目的基因轉(zhuǎn)染組再分為四組:對照組(給予磷酸鹽緩沖液(PBS)),100μmol/l麥芽酚鋁組,200μmol/l麥芽酚鋁組,400μmol/l麥芽酚鋁組。轉(zhuǎn)染基因24小時后進行染毒,染毒后24小時收集細胞及細胞上液進行各項指標(biāo)檢測。采用CCK-8法測定細胞活力;RT-PCR檢測BACEm RNA水平;ELISA檢測BACE蛋白,Aβ1-40,Aβ1-42水平。3、依據(jù)動物體內(nèi)實驗結(jié)果,選擇PC12細胞進行體外培養(yǎng)干預(yù)實驗,將實驗組分為對照組(給予PBS),PDTC100μmol/L組,200μmol/l麥芽酚鋁組,200μmol/l麥芽酚鋁+PDTC100μmol/l組。染毒和干預(yù)后24小時收集細胞及細胞培養(yǎng)液測定各項指標(biāo)。采用CCK-8法測定細胞活力;RT-PCR檢測mi R29a,mi R29b1,BACEm RNA水平;ELISA檢測BACE蛋白水平,Aβ1-40,Aβ1-42水平。結(jié)果: 1、動物整體實驗結(jié)果:(1)隨著染毒劑量的不斷增加,染毒劑量組大鼠血鋁明顯升高。低、中、高劑量組的血鋁水平分別為(92.05±5.63)μg/l,(111.74±5.88)μg/l,(165.50±9.79)μg/l,較對照組(47.76±6.58)μg/l相比明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);腦皮質(zhì)中鋁含量在低、中、高劑量組(31.40±5.74)ng/g,(72.36±4.79)ng/g,(93.37±3.04)ng/g,較對照組(12.11±1.42)ng/g明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);大鼠腦海馬中鋁含量在低中高劑量組分別為(51.72±6.04)ng/g,(86.92±5.38)ng/g,(106.24±6.18)ng/g,較對照組(11.67±1.04)ng/g明顯升高,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(2)隨染毒劑量的增高,皮質(zhì)和海馬內(nèi)Aβ總量(Aβ1-40和Aβ1-42總和)增高,與對照組相比,皮質(zhì)內(nèi)高劑量組Aβ總量增高有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),在海馬內(nèi)中、高劑量組Aβ總量增高有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);其中Aβ1-40變化不明顯,在皮質(zhì)和海馬內(nèi)各染毒組與對照組相比沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);而Aβ1-42有顯著增高,與對照組相比,皮質(zhì)內(nèi)高劑量組增高有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),海馬內(nèi)低、中、高劑量組Aβ1-42增高均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(3)隨著染毒劑量的增高,皮質(zhì)和海馬內(nèi)BACEm RNA,BACE蛋白成升高趨勢。與對照組相比,在大鼠腦皮質(zhì)內(nèi),低劑量組BACEm RNA,BACE蛋白增高沒有統(tǒng)計學(xué)意義,中、高劑量組BACEm RNA和BACE蛋白增高均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);在大鼠腦海馬內(nèi),BACEm RNA和BACE蛋白增高在各染毒劑量組均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。且BACE蛋白與Aβ總量相關(guān),(皮質(zhì)中R=0.618,P0.01,海馬中R=0.796,P0.01);BACE蛋白與Aβ1-42相關(guān)(皮質(zhì)中R=0.608,P0.01海馬中R=0.804,P0.01)。(4)mi R29a,mi R29a*,mi R29b1,miRb2,mi Rc1,mi Rc2均呈現(xiàn)降低趨勢。在皮質(zhì)和海馬內(nèi),各染毒組mi R29a*,mi Rb2,mi Rc1,mi Rc2較對照組降低均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);但經(jīng)過相關(guān)分析,在皮質(zhì)內(nèi)mi R29a*,mi Rb2,mi Rc1,mi Rc2均與BACEm RNA及BACE蛋白均無相關(guān)性(r=-0.238,-0.261,P0.05;r=-0.235,-0.238,P0.05;r=-0.216,-0.297,P0.05;r=-0.237,-0.296,P0.05),在海馬內(nèi)mi R29a*,mi Rb2,mi Rc1,mi Rc2均與BACEm RNA及BACE蛋白均無相關(guān)性(r=-0.332,-0.317,P0.05;r=-0.323,-0.317,P0.05;r=-0.404,-0.479,P0.05;r=-0.370,-0.353,P0.05)。在皮質(zhì)和海馬內(nèi),與對照組相比,mi R29a,mi R29b1低,中劑量組升高無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),高劑量組升高有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),且經(jīng)過相關(guān)分析,在皮質(zhì)內(nèi)mi R29a與BACEm RNA及BACE蛋白均有顯著相關(guān)性(r=-0.991,-0.987,P0.05),mi R29b1與BACEm RNA及BACE蛋白均有顯著相關(guān)性(r=-0.969,-0.992,P0.05);在海馬內(nèi)mi R29a與BACEm RNA及BACE蛋白均有顯著相關(guān)性(r=-0.963,-0.981,P0.05),mi R29b1與BACEm RNA及BACE蛋白均有顯著相關(guān)性(r=-0.983,-0.991,P0.05)。(5)核蛋白NF-κB/P65在皮質(zhì)和海馬中呈升高趨勢。在皮質(zhì)和海馬中,與對照組相比較,NF-κB/P65在低劑量組升高無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),NF-κB/P65在中、高劑量組升高有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2、細胞轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果:mi R29a,mi R29b1轉(zhuǎn)染后24h后,轉(zhuǎn)染水平達到最高,目的基因轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染陰性對照組比較,轉(zhuǎn)染組mi R29a,mi R29b1水平可升高500倍左右。隨后逐漸下降,72h后降至100倍水平左右。當(dāng)轉(zhuǎn)染組mi R29a,mi R29b1水平到達最高,即24h時,進行染毒,染毒后24h(轉(zhuǎn)染后48 h)收集細胞核細胞上液進行實驗。(1)各組細胞的形態(tài)學(xué)改變:對照組,轉(zhuǎn)染陰性對照組、轉(zhuǎn)染陽性對照組(轉(zhuǎn)染目的基因mi R29a或mi R29b1,給予PBS組)細胞生長狀態(tài)良好,細胞大小一致、均勻,貼壁良好,細胞密集,連接較多;轉(zhuǎn)染低劑量組有少數(shù)死亡細胞,連接減少,其余變化不明顯;轉(zhuǎn)染中劑量組細胞狀態(tài)稍有變差,細胞數(shù)量減少,細胞貼壁性變差,出現(xiàn)部分細胞皺縮呈圓形,連接減少;轉(zhuǎn)染高劑量組細胞形態(tài)變化較為明顯,數(shù)量進一步減少,較多細胞皺縮呈圓形,細胞貼壁不緊,細胞間連接極為松散。各未轉(zhuǎn)染細胞狀態(tài)較轉(zhuǎn)染組細胞狀態(tài)差。轉(zhuǎn)染mi R29a,mi R29b1細胞形態(tài)表現(xiàn)相似。(2)細胞活力測定結(jié)果顯示,對照組,轉(zhuǎn)染陰性對照組、轉(zhuǎn)染陽性對照組各組細胞活力無明顯差別(P0.05),與對照組相比,未轉(zhuǎn)染組隨著染毒劑量的升高,細胞活力明顯降低,與對照組相比,各組降低均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);轉(zhuǎn)染染毒組與對照組相比,細胞活力有一定降低(P0.05),低、中劑量組無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),高劑量組降低有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);各相同染毒劑量組相比,轉(zhuǎn)染組細胞活力較未轉(zhuǎn)染組細胞活力明顯回升(P0.05)。轉(zhuǎn)染mi R29a,mi R29b1細胞活力結(jié)果相似。(3)各組細胞BACEmRNA,BACE水平的變化:空白對照組,轉(zhuǎn)染陰性對照組BACEm RNA,BACE表達水平無明顯差別(P0.05);與對照組相比,未轉(zhuǎn)染組隨著染毒劑量的升高,BACEm RNA,BACE明顯升高(P0.05);轉(zhuǎn)染組各組與對照組相比,BACEm RNA差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),陽性對照組、轉(zhuǎn)染低劑量組較空白對照組BACE水平降低,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),轉(zhuǎn)染中、高劑量組BACE水平降低無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);各相同染毒劑量組相比,轉(zhuǎn)染組細胞中BACEm RNA,BACE較未轉(zhuǎn)染組細胞BACEm RNA,BACE表達水平明顯降低,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。轉(zhuǎn)染mi R29a,mi R29b1細胞BACEmRNA,BACE表達水平結(jié)果相似。(4)各組細胞Aβ含量的變化:與空白對照組相比,各組Aβ總量有變化(P0.05),空白對照組,轉(zhuǎn)染陰性對照組Aβ總量無明顯差別(P0.05);轉(zhuǎn)染陽性對照組Aβ總量較空白對照組水平出現(xiàn)降低(P0.05),與對照組相比,未轉(zhuǎn)染組隨著染毒劑量的升高,Aβ總量明顯升高,與對照組相比,Aβ總量各組升高均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);轉(zhuǎn)染染毒組與對照組相比,Aβ總量水平降低(P0.05),低劑量組有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),中、高劑量組降低無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);其中,與空白對照組相比,各組Aβ1-40含量有變化(P0.05),未轉(zhuǎn)染中、高劑量染毒組較對照組Aβ1-40含量升高(P0.05),陽性轉(zhuǎn)染對照組,轉(zhuǎn)染低劑量組較空白對照組相比Aβ1-40含量明顯降低(P0.05),轉(zhuǎn)染中、高劑量染毒組較空白對照組Aβ1-40含量無明顯差異(P0.05),各相同染毒劑量組相比,轉(zhuǎn)染組細胞中Aβ1-40含量較未轉(zhuǎn)染組細胞Aβ總量水平明顯降低,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與空白對照組相比,各組Aβ1-42含量有變化(P0.05),空白對照組,轉(zhuǎn)染陰性對照組Aβ1-42含量無明顯差別(P0.05);與對照組相比,未轉(zhuǎn)染組隨著染毒劑量的升高,Aβ1-42含量出現(xiàn)明顯升高(P0.05),轉(zhuǎn)染陽性對照組、轉(zhuǎn)染低劑量組Aβ1-42含量較空白對照組水平出現(xiàn)降低(P0.05),轉(zhuǎn)染中、高劑量組Aβ1-42含量降低無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);各相同染毒劑量組相比,轉(zhuǎn)染組細胞中Aβ1-42含量較未轉(zhuǎn)染組細胞Aβ1-42含量水平明顯降低,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);3、細胞干預(yù)實驗結(jié)果(1)各組細胞形態(tài)學(xué)變化情況:對照組,100μmol/l PDTC組細胞生長狀態(tài)良好,細胞大小一致、均勻,貼壁性良好,細胞密集,細胞凸起長而多,連接豐富緊密;200μmol/l麥芽酚鋁組細胞狀態(tài)較差,細胞數(shù)量減少,細胞貼壁性變差,出現(xiàn)部分細胞皺縮呈圓形,連接減少松散;200μmol/l麥芽酚鋁+100μmol/l PDTC組細胞狀態(tài)轉(zhuǎn)好,細胞凸起增多,連接增加且密集型也增加。(2)各組細胞活力變化情況:各組細胞細胞活力有差異(P0.05);對照組,100μmol/l PDTC組細胞活力無明顯差異(P0.05),與對照組相比,200μmol/l麥芽酚鋁組細胞活力明顯降低(P0.05);200μmol/l麥芽酚鋁+100μmol/l PDTC組細胞活力較200μmol/l麥芽酚鋁組升高(P0.05),但較對照組低(P0.05)。(3)各組細胞mi R29a,mi R29b1水平:各組細胞中mi29a表達有差異(P0.05);與對照組相比,100μmol/l PDTC組細胞中mi R29a表達有升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),200μmol/l麥芽酚鋁組細胞中mi R29a表達明顯降低(P0.05);200μmol/l麥芽酚鋁+100μmol/l PDTC組細胞中mi R29a較200μmol/l麥芽酚鋁組升高(P0.05),但較對照組低(P0.05)。各組細胞中mi R29b1有差異(P0.05);與對照組相比,100μmol/l PDTC組細胞mi R29b1表達有升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),200μmol/l麥芽酚鋁組細胞中mi29b1明顯降低(P0.05);200μmol/l麥芽酚鋁+100μmol/l PDTC組細胞中mi29b1較200μmol/l麥芽酚鋁組升高(P0.05),但較對照組低(P0.05)。(4)各組細胞BACEm RNA,BACE水平的變化:各組細胞中BACEm RNA有差異(P0.05);與對照組相比,100μmol/l PDTC組細胞中BACEm RNA表達有降低,但沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),200μmol/l麥芽酚鋁組細胞中BACEm RNA表達明顯升高(P0.05);200μmol/l麥芽酚鋁+100μmol/l PDTC組細胞中BACEm RNA較200μmol/l麥芽酚鋁組降低,但無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。各組細胞中BACE有差異(P0.05);與對照組相比,100μmol/l PDTC組細胞BACE表達有降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),200μmol/l麥芽酚鋁組細胞中BACE明顯升高,200μmol/l麥芽酚鋁+100μmol/l PDTC組細胞中BACE較200μmol/l麥芽酚鋁組降低(P0.05),但較對照組高(P0.05)。(5)各組細胞染毒后Aβ含量的變化:各組細胞中Aβ總量有差異(P0.05);與對照組相比,100μmol/l PDTC組細胞中Aβ總量有降低(P0.05),200μmol/l麥芽酚鋁組細胞中Aβ總量明顯升高(P0.05);200μmol/l麥芽酚鋁+100μmol/l PDTC組細胞中Aβ總量較200μmol/l麥芽酚鋁組降低(P0.05),但較對照組高(P0.05)。其中Aβ1-40含量在各組細胞中有差異(P0.05);與對照組相比,100μmol/l PDTC組細胞Aβ1-40含量有降低,但沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),200μmol/l麥芽酚鋁組細胞中Aβ1-40含量明顯增加(P0.05);200μmol/l麥芽酚鋁+100μmol/l PDTC組細胞中Aβ1-40含量較200μmol/l麥芽酚鋁組降低(P0.05),但較對照組高(P0.05)。各組Aβ1-42有變化(P0.05),與對照組相比,100μmol/l PDTC組細胞Aβ1-42含量降低(P0.05),200μmol/l麥芽酚鋁組細胞中Aβ1-42含量明顯增加(P0.05);200μmol/l麥芽酚鋁+100μmol/l PDTC組細胞中Aβ1-42含量較200μmol/l麥芽酚鋁組降低(P0.05),但較對照組高(P0.05)。結(jié)論：1、麥芽酚鋁可以提高大鼠血鋁和腦鋁水平,在腦皮質(zhì)和海馬中蓄積均比較明顯。2、麥芽酚鋁可以引起大鼠腦皮質(zhì)和海馬內(nèi)Aβ1-42沉積,其機制可能與鋁可以降低mi R29a,mi R29b1水平,從而引起大鼠腦內(nèi)BACEm RNA,BACE水平升高有關(guān)。3、鋁可能通過影響腦內(nèi)NF-κB從而影響大鼠腦內(nèi)mi R29水平。
【關(guān)鍵詞】：麥芽酚鋁 Aβ沉積 BACE miR29 NF-κB
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R135.1
【目錄】：

• 中文摘要6-12
• 英文摘要12-18
• 常用縮寫詞中英文對照表18-20
• 前言20-25
• 第一部分 鋁對大鼠腦內(nèi)miR29、BACE和Aβ 的影響25-54
• 1 材料與方法25-36
• 1.1 實驗材料25-27
• 1.2 實驗方法27-36
• 1.3 統(tǒng)計分析方法36
• 2 結(jié)果36-49
• 2.1 實驗動物基本情況36-38
• 2.2 染鋁大鼠血鋁、腦皮質(zhì)和海馬鋁水平38-40
• 2.3 染鋁大鼠腦皮質(zhì)和海馬內(nèi)Aβ 的水平40-43
• 2.4 染鋁大鼠腦皮質(zhì)和海馬內(nèi)BACEm RNA和BACE蛋白表達的變化43-45
• 2.5 染鋁大鼠腦皮質(zhì)和海馬內(nèi)miRNA29的表達45-49
• 3 討論49-53
• 4 結(jié)論53-54
• 第二部分 Mi R29a, b1調(diào)控BACE在鋁致Aβ 沉積過程中的機制54-78
• 1 材料與方法54-60
• 1.1 實驗材料54-56
• 1.2 實驗方法56-60
• 1.3 統(tǒng)計分析方法60
• 2 結(jié)果60-75
• 2.1 轉(zhuǎn)染后不同時點miR29a, miR29b1的表達情況60-62
• 2.2 各組細胞的形態(tài)學(xué)變化62-64
• 2.3 各組細胞活力的變化64-65
• 2.4 各組細胞染毒后BACEm RNA和BACE水平的變化65-69
• 2.5 各組細胞染毒后Aβ 的含量的變化69-75
• 3 討論75-77
• 4 結(jié)論77-78
• 第三部分 NF-κB在miR29a, b1調(diào)節(jié)鋁致腦內(nèi)Aβ 沉積過程的作用78-93
• 1 材料與方法79-82
• 1.1 實驗材料79-80
• 1.2 實驗方法80-82
• 1.3 統(tǒng)計分析方法82
• 2 結(jié)果82-89
• 2.1 大鼠腦皮質(zhì)和海馬中NF-κB/p65表達的變化82-83
• 2.2 各組細胞形態(tài)學(xué)變化情況83-84
• 2.3 各組細胞活力的變化84-85
• 2.4 各組細胞miR29a, miR29b1的變化85-86
• 2.5 各組細胞BACEm RNA和BACE水平的變化86-87
• 2.6 各組細胞Aβ 的含量的變化87-89
• 3 討論89-92
• 4 結(jié)論92-93
• 總結(jié)93-94
• 參考文獻94-101
• 綜述101-116
• 綜述參考文獻109-116
• 致謝116-118
• 在學(xué)期間承擔(dān)/參與的科研課題與研究成果118-119
• 個人簡歷119

【參考文獻】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王林平;鋁致大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡分子機制的體內(nèi)實驗研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2005年

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本文編號：994520