本文關(guān)鍵詞：NLR家族分子和DAMP家族CRT分子在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其分子機(jī)制

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【摘要】：第一部分:NLR家族分子在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其分子機(jī)制目的和方法:NOD樣受體(NOD-like receptors,NLRs)是固有免疫和炎癥的重要調(diào)節(jié)分子,一部分NLRs識(shí)別相應(yīng)配體之后能夠募集Caspase-1形成一種蛋白復(fù)合物:炎性小體,進(jìn)一步促進(jìn)促炎因子的產(chǎn)生,另一部分NLRs參與調(diào)節(jié)NF-κB和MAPK信號(hào)通路,從而啟動(dòng)固有免疫和獲得性免疫。炎癥和腫瘤間存在著密切的聯(lián)系,潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩等炎癥性腸炎是誘發(fā)結(jié)直腸癌的主要病因之一。至今為止,已有很多關(guān)于NLRs在小鼠結(jié)直腸癌模型中的研究,如Nlrx1-/-小鼠是結(jié)腸炎以及結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌模型的易感小鼠;小鼠Nlrp6和Nlrp12基因的缺失都會(huì)導(dǎo)致結(jié)直腸癌進(jìn)展加快,惡性程度增高;但是有關(guān)NLR分子在人結(jié)直腸癌中表達(dá)分析的報(bào)道卻很少。鑒于此,我們1)選擇與腫瘤潛在相關(guān)的NLR家族分子:NLRP1,NLRP3,NLRP6,NLRP12,NLRC3,NLRC4,NLRC5,NOD1,NOD2,NLRX1以及與NLR家族分子結(jié)構(gòu)功能相似的AIM2分子分析其在10個(gè)已收錄在生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫Oncomine平臺(tái)的人結(jié)直腸癌腫瘤數(shù)據(jù)庫的表達(dá)水平;2)使用Taqman熒光探針實(shí)時(shí)定量PCR,分析了這些基因在40例人結(jié)直腸癌和癌旁組織中m RNA的表達(dá)水平,并分析了它們與炎性小體相關(guān)分子(ASC和Caspase 1)以及細(xì)胞因子(IL-1β和IL-18)表達(dá)的相關(guān)性;3)選擇在人結(jié)直腸癌中表達(dá)水平明顯下調(diào)的NLRX1分子,觀測其在數(shù)據(jù)庫和40例人結(jié)直腸癌和癌旁組織中的表達(dá),并利用Nlrx1-/-基因敲除小鼠建立三種結(jié)直腸癌模型,全面觀測NLRX1/Nlrx1在人和小鼠結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。結(jié)果:1)分析Oncomine上最大、病人信息最全、有237例標(biāo)本的結(jié)直腸癌TCGA數(shù)據(jù)庫,發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌中NLR家族分子和AIM2的表達(dá)趨勢可以分為三類:重要的炎癥相關(guān)分子NLRC3和NLRX1,以及可以形成炎性小體的NLRP1,NLRP3,NLRC4和AIM2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平明顯低于其在正常組織中的表達(dá)水平;而NOD1和NOD2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平顯著上調(diào);但NLRC5、NLRP6以及NLRP12在結(jié)直腸癌組織和正常組織間的表達(dá)水平無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;2)40例病人組織分析結(jié)果表明NLRC3、NLRP3和NLRX1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平明顯低于其在正常組織中的表達(dá)水平;3)進(jìn)一步分析Oncomine另外九個(gè)結(jié)直腸癌數(shù)據(jù)庫,進(jìn)一步證實(shí)NLRC3、NLRP3和NLRX1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平明顯低于正常組織;4)在三種結(jié)直腸癌模型中,Nlrx1-/-小鼠與正常野生小鼠相比其結(jié)腸組織有大量的炎性息肉產(chǎn)生,同時(shí)NF-κB、MAPK和STAT3活化水平上調(diào),IL-6的分泌增加。提示由于Nlrx1基因的缺失,導(dǎo)致NF-κB的活化以及結(jié)腸炎性息肉的形成。結(jié)論:1)40例人結(jié)直腸癌標(biāo)本結(jié)合人結(jié)直腸癌數(shù)據(jù)庫結(jié)果分析證實(shí)NLRC3、NLRP3和NLRX1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平明顯低于正常組織;2)證實(shí)Nlrx1分子的缺失導(dǎo)致小鼠結(jié)直腸癌病情加劇、進(jìn)展加速,在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中可能有潛在的保護(hù)作用。第二部分:DAMP家族CRT分子在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其分子機(jī)制目的和方法:損傷相關(guān)分子模式(Damage associated molecular patterns,DAMPs)是由死亡的、應(yīng)激的或是損傷的細(xì)胞釋放、分泌或者暴露于細(xì)胞表面的分子,可以為免疫系統(tǒng)提供危險(xiǎn)信號(hào),進(jìn)而誘發(fā)免疫原性的細(xì)胞死亡(Immunogenic tumor cell death,ICD)。鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin,CRT)是DAMPs家族分子的一員。研究表明,CRT在腫瘤細(xì)胞死亡早期,從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜,是ICD的主要誘因之一。進(jìn)而,轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上的CRT會(huì)進(jìn)一步被剪切,釋放入血液中,成為潛在的腫瘤標(biāo)志物。已有文獻(xiàn)報(bào)道,在肝癌患者血清和膀胱癌患者尿液中,可溶型CRT水平顯著增高。肺癌是目前常見的惡性腫瘤之一,尚未見肺癌患者血清中s CRT表達(dá)水平的報(bào)道。因此,檢測肺癌患者血清中s CRT表達(dá)水平并進(jìn)一步研究CRT在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其分子機(jī)制是一個(gè)值得深入討論的問題。1)我們應(yīng)用此抗原免疫BALB/c小鼠,制備并鑒定小鼠抗人CRT單克隆抗體;2)在此基礎(chǔ)上建立可溶型CRT夾心ELISA檢測試劑盒。應(yīng)用此夾心ELISA試劑盒,檢測正常人和肺癌患者血清中可溶型CRT水平;3)觀測CRT分子在人肺癌組織中的表達(dá)及其與肺癌病理分型和分化程度的相關(guān)性;4)應(yīng)用肺癌細(xì)胞系初步研究CRT膜轉(zhuǎn)位的機(jī)制。結(jié)果:1)制備并鑒定了26株小鼠抗人CRT單克隆抗體;成功建立了可溶型CRT夾心ELISA試劑盒,其檢測下限為0.09ng/ml;2)應(yīng)用此ELISA試劑盒,發(fā)現(xiàn)58例肺癌患者血清中可溶型CRT的表達(dá)水平顯著高于正常人血清中可溶型CRT水平;肺癌鱗癌患者血清中的可溶型CRT的表達(dá)水平顯著高于腺癌、小細(xì)胞肺癌;3)免疫組化結(jié)果顯示,CRT在肺癌組織上的表達(dá)與肺癌病理類型和分化程度有著明顯的相關(guān)性;4)p38MAPK、ERK、JNK或AKT-PI3K通路抑制劑SB203580、U0126、PD98059或LY294002及其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑衣霉素(Tunicamycin)或毒胡蘿卜素(Thapsigargin)等藥物,可在不同程度上(12-24小時(shí))誘導(dǎo)CRT在m RNA水平表達(dá)明顯上調(diào),但是流式檢測發(fā)現(xiàn)CRT轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上的表達(dá)上調(diào)不明顯。另外,新的藥物BRAF V600e抑制劑PLX4720可在1h內(nèi)使CRT在胞內(nèi)表達(dá)水平顯著升高,胞膜平均熒光強(qiáng)度顯示CRT分子有潛在的膜轉(zhuǎn)位趨勢。結(jié)論:成功建立了可溶型CRT夾心ELISA檢測試劑盒;肺癌患者血清中可溶型CRT水平顯著升高;CRT在肺癌組織上的表達(dá),隨著分化程度的降低,從胞漿到胞膜的膜轉(zhuǎn)位增加;在肺癌細(xì)胞系上用藥物誘導(dǎo),模擬CRT膜轉(zhuǎn)位的過程,發(fā)現(xiàn)BRAF V600e抑制劑PLX4720可在1h內(nèi)使CRT在胞內(nèi)表達(dá)水平顯著升高,胞膜平均熒光強(qiáng)度顯示CRT分子有潛在的膜轉(zhuǎn)位趨勢,有待進(jìn)一步研究。
【關(guān)鍵詞】：NLRs 炎性小體 結(jié)直腸癌 NLRX1 腫瘤生物信息學(xué)分析 損傷相關(guān)分子模式 鈣網(wǎng)蛋白 肺癌 免疫組化 CLEIA檢測試劑盒
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R730.2
【目錄】：

• 縮略語表7-9
• 中文摘要9-13
• ABSTRACT13-17
• 前言17-19
• 文獻(xiàn)回顧19-38
• 1 NLR家族分子概述19-20
• 2 NLR家族分子的結(jié)構(gòu)和命名20-24
• 3 NLR家族分子的分類和功能24-32
• 3.1 形成炎性小體的NLR家族分子24-28
• 3.1.1 NLRP325-26
• 3.1.2 NLRP626-28
• 3.1.3 AIM228
• 3.2 非形成炎性小體的NLR家族分子28-32
• 3.2.1 NLRP1229-30
• 3.2.2 NLRX130-31
• 3.2.3 NLRC331-32
• 4 NLR家族分子在人結(jié)直腸癌中的研究現(xiàn)狀32-33
• 5 損傷相關(guān)分子模式家族CRT分子的研究現(xiàn)狀33-38
• 5.1 DAMPs家族分子簡介33-35
• 5.2 鈣網(wǎng)蛋白和腫瘤免疫原性細(xì)胞死亡35-37
• 5.3 可溶型CRT分子在人腫瘤中的相關(guān)研究37-38
• 第一部分：NLR家族分子在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用和分子機(jī)制38-76
• 實(shí)驗(yàn)一：NLR家族分子在人結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其與炎性因子的相關(guān)性38-55
• 1 材料方法38-40
• 1.1 基于Oncomine腫瘤數(shù)據(jù)庫的生物信息學(xué)分析38-39
• 1.2 結(jié)直腸癌臨床標(biāo)本的收集39
• 1.3 從FFPE組織中提取RNA39
• 1.4 實(shí)時(shí)定量PCR39-40
• 1.5 熱點(diǎn)圖和層次聚類分析40
• 1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析40
• 2 結(jié)果40-53
• 2.1 基于Oncomine腫瘤數(shù)據(jù)庫的人結(jié)直腸癌數(shù)據(jù)分析40-46
• 2.2 NLR家族分子在40例人結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中的表達(dá)46-48
• 2.3 炎性小體相關(guān)基因與NLR家族分子表達(dá)水平相關(guān)性分析48-50
• 2.4 NLR家族分子在Oncomine平臺(tái)其它結(jié)直腸癌數(shù)據(jù)庫中表達(dá)分析50-53
• 3.討論53-55
• 實(shí)驗(yàn)二：NLRX1分子在人和小鼠結(jié)直腸癌中的作用研究55-76
• 1 材料方法55-58
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物55-56
• 1.2 流式細(xì)胞術(shù)鑒定小鼠骨髓移植效率56
• 1.3 結(jié)腸息肉計(jì)數(shù)及評(píng)估56
• 1.4 小鼠結(jié)直腸癌組織體外FRI成像56-57
• 1.5 結(jié)腸組織的HE染色57
• 1.6 小鼠結(jié)腸RNA的提取及實(shí)時(shí)定量分析57
• 1.7 Western Blots57-58
• 1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析58
• 2 結(jié)果58-75
• 2.1 NLRX1分子在人結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平及其與結(jié)直腸癌臨床分級(jí)的關(guān)系58-60
• 2.2 Nlrx1基因敲除小鼠在不同結(jié)直腸癌模型中的表型及其機(jī)制的初步分析60-75
• 3 討論75-76
• 第二部分：DAMP家族CRT分子在肺癌發(fā)生發(fā)展中的表達(dá)和功能76-98
• 實(shí)驗(yàn)三：CRT分子在肺癌血清和組織標(biāo)本中的表達(dá)和功能76-98
• 1 材料和方法76-79
• 1.1 CRT單克隆抗體的制備76
• 1.2 病人標(biāo)本的收集76-77
• 1.3 可溶型CRT夾心ELISA試劑盒的建立77
• 1.4 可溶型CRT ELISA試劑盒優(yōu)化77
• 1.5 流式細(xì)胞術(shù)77
• 1.6 Western blot77-78
• 1.7 免疫組化78
• 1.8 信號(hào)通路抑制劑相關(guān)實(shí)驗(yàn)的材料和方法78-79
• 1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析79
• 2 結(jié)果79-96
• 2.1 制備并鑒定CRT單抗79-81
• 2.2 建立高敏感性可用于檢測可溶型CRT分子的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒81-82
• 2.3 58例肺癌患者血清可溶型CRT的檢測82-83
• 2.4 肺癌組織標(biāo)本中CRT表達(dá)水平及其與腫瘤細(xì)胞分化程度的關(guān)系83-85
• 2.5 CRT膜轉(zhuǎn)位相關(guān)機(jī)制研究85-96
• 3 討論96-98
• 小結(jié)98-99
• 第一部分98
• 第二部分98-99
• 參考文獻(xiàn)99-110
• 附錄110-115
• 個(gè)人簡歷和研究成果115-118
• 個(gè)人簡歷115
• 博士研究生期間論文發(fā)表情況115-118
• SCI論文115-116
• 中文論文116
• 參與編寫專著116-117
• 專利117-118
• 致謝118

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本文編號(hào)：995644