本文關(guān)鍵詞：尿液exosomes的分離、富集、純化及其內(nèi)部蛋白指紋圖譜分析

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【摘要】：研究背景1987年,Johnstone等在研究網(wǎng)織紅細(xì)胞的成熟過程中,通過羊網(wǎng)織紅細(xì)胞體外培養(yǎng)的上清超速離心后,收集到一種直徑60 nm的囊性小泡,其將這些納米級的小囊泡即命名為exosomes。 exosomes由脂質(zhì)雙分子層、跨膜蛋白、1mRNAs和microRNAs組成,密度在1.13ug/ml到1.19g/ml之間,在電子顯微鏡下呈杯狀。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肥大細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、肝細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞、血小板、等多種細(xì)胞都能釋放exosomes o人體生理體液,包括血液、尿液、母乳、羊水、精液、唾液、關(guān)節(jié)滑液、胸腹水、肺泡沖洗液、等中也都存在exosoemso exosomes被釋放到細(xì)胞外不僅僅是為了單純地清除細(xì)胞內(nèi)廢棄的蛋白,它還參與了細(xì)胞間的通訊。其能夠作為細(xì)胞間的載體,傳遞生物的生理和病理信息,參與了多種不同的生理及病理過程。不同細(xì)胞來源的exosomes含有不同的分子組成,也具有與其來源細(xì)胞相似或相同的生物學(xué)功能。同樣,exosomes中細(xì)胞特異性蛋白的存在也可以反應(yīng)其來源細(xì)胞及其功能。目前對exosomes的研究不僅僅在其功能方面,更是到實(shí)際的應(yīng)用—即診斷和治療方法方面的開發(fā)。鑒于exosomes含有大量的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、mRNA、microRNA等生物信息,能調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、血管新生、細(xì)胞增殖以及腫瘤細(xì)胞侵襲,其可以作為非常理想的生物標(biāo)記物來源,有望在多種疾病的早期診斷中發(fā)揮作用。目前也有不少關(guān)于對血液、尿液、唾液等exosomes勺研究發(fā)現(xiàn)了多種疾病的生物標(biāo)記物,有望對指導(dǎo)疾病的早期與個(gè)體化治療帶來新的希望。2004年,Pisitkun等首先報(bào)道在尿液中發(fā)現(xiàn)并分離出exosomes。人體尿液中含有大量的exosomes,其可以由泌尿系統(tǒng)(包括腎臟、膀胱、前列腺)的所有上皮細(xì)胞釋放進(jìn)入尿液。尿液exosoems與其它類型的exosomes一樣,攜帶大量來源細(xì)胞的信息,十分有利于探索特定細(xì)胞的生理功能與病理變化。通過蛋白組學(xué)等方法人們已經(jīng)在分離出的正常人尿液exosomes中鑒定出超過1000種蛋白質(zhì)。尿液相對于其它體液具有無創(chuàng)、大量的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn),對泌尿系統(tǒng)疾病的早期診斷生物標(biāo)記物、治療和監(jiān)測的靶點(diǎn)以及疾病的發(fā)病機(jī)制等研究具有極大的意義。近年來的一些研究發(fā)現(xiàn),尿液exosomes蛋白譜的變化可以反映某些特定的腎臟病變情況。Exosomes可以攜帶信息穿梭于腎臟細(xì)胞之間,改變受體細(xì)胞蛋白譜與功能,這可能代表著一種腎單位內(nèi)細(xì)胞與細(xì)胞間的信號(hào)傳遞機(jī)制。近年來結(jié)合尿exosomes分離技術(shù)及先進(jìn)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)檢測出不少腎臟結(jié)構(gòu)與功能損害相關(guān)的尿exosomes生物標(biāo)記物。尿液exosomes的發(fā)現(xiàn)對糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制、早期診斷和監(jiān)測標(biāo)記物的研究帶來了新的方向。最近(2014年)Zubiri I等發(fā)表在《J Protromics》上的論文報(bào)道其在對糖尿病腎病患者尿液exosomes質(zhì)譜分析結(jié)果,其首先比較了兩種目前常用的尿液exosomes分離富集方法,然后選擇較適宜的方法進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析。結(jié)果顯示AMBP、MLL3、 VDAC1這三種蛋白在糖尿病腎病與正常組尿液exsomes中表達(dá)差異,可以作為糖尿病腎病早期診斷的備選生物標(biāo)記物。除上述研究外,還有尿exosomes用于急性腎損傷、多囊腎、腎臟纖維化、膀胱癌等疾病的報(bào)道。尿液exosomes給腎臟病等泌尿系統(tǒng)疾病的研究帶來了極大的前景,但日前還處于初期階段,很多研究中面臨的問題與挑戰(zhàn)有待解決。首當(dāng)其沖的就是尿液exosomes的分離、富集和純化問題。到目前為止還沒有統(tǒng)一的得到一致認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)方法。目前國際上主要使用的分離、富集方法有兩大類：一種以超速離心為基礎(chǔ),第二種方法是以納米膜離心超濾為基礎(chǔ),但這兩種主要的方法均有缺點(diǎn)。另外目前所有尿液exosomes富集與純化過程中而臨的另外一個(gè)非常棘手的問題就是正常人尿液中大量存在的Tamm-Horsfall蛋白(THP)的干擾。THP在尿液中聚合成幾微米長的雙螺旋繩索樣結(jié)構(gòu),將很多exsomes包裹其中,在分離exosomes時(shí)這些THP蛋白同時(shí)沉淀下來,從而會(huì)影響后續(xù)的exosomes蛋白質(zhì)組學(xué)分析。目前尚無研究報(bào)道可以在exosomes中完全消除THP等外部蛋白的干擾從而使尿exosoems得到完全的純化。缺乏尿液exosomes相關(guān)檢測指標(biāo)(如內(nèi)部某種蛋白生物標(biāo)記物)的標(biāo)準(zhǔn)化方法也是影響后續(xù)臨床應(yīng)用的一個(gè)問題。不同尿液標(biāo)本稀釋程度的差異決定了不能直接以實(shí)際測得的尿液exosomes相關(guān)指標(biāo)來作正常與異常的比較。臨床上目前應(yīng)用尿肌酐來校正尿白蛋白濃度的方法欠準(zhǔn)確,而應(yīng)用exosomes本身的標(biāo)記物蛋白如TSG101或者Alix蛋白來校正的方法又比較復(fù)雜,過程較慢。因此有必要尋求一種較簡單、實(shí)用的exosomes相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)化指標(biāo)。本研究團(tuán)隊(duì)經(jīng)過兩年的前期研究創(chuàng)立了一種新的exosomes分離、富集方法-“液壓透析法(hydrostatic dialysis)'’。該方法具有設(shè)備簡單、成本低、處理量大,尿液中干擾性的可溶性蛋白有效清除,排除個(gè)體間exosomes外其它因素差異對后續(xù)生物學(xué)分析的影響(如不同尿液來源的酸堿程度差異在本方法處理后處在同一PH水平),最大程度減少了exosomes的損失,而且可以與超速離心、超濾方法上述兩種分離、富集方法相結(jié)合用于不同目的的研究等主要優(yōu)點(diǎn)。該方法在大規(guī)模推廣應(yīng)用前需要進(jìn)一步通過中國人群不同腎病程度的尿液標(biāo)本來驗(yàn)證該方法的可重復(fù)性與有效性。另外我們將在此方法分離、富集尿液exosomes基礎(chǔ)上探討可作為尿液exosomes成分標(biāo)準(zhǔn)化的候選指標(biāo)。同時(shí),進(jìn)一步應(yīng)用還原、烷基化、Trypsin酶解等方法探索對尿液exosomes的完全純化(即完全清除exosomes外的干擾蛋白)。在純化的尿液exosomes基礎(chǔ)上,通過質(zhì)譜分析了解尿液exosomes內(nèi)部蛋白指紋圖譜。方法1.尿液標(biāo)本的選取與收集“液壓透析法”驗(yàn)證研究標(biāo)本從-80℃超低溫冰箱所保存的中國人群尿液樣本庫中選取,包括正常人群組、前驅(qū)糖尿病組、糖尿病無蛋白尿組、糖尿病微量白蛋白尿組、糖尿病大量蛋白尿組尿液樣本。標(biāo)準(zhǔn)化、純化及質(zhì)譜分析研究選取都柏林城市大學(xué)健康志愿者提供的尿液標(biāo)本。所有入組對象均簽署經(jīng)都柏林城市大學(xué)國家生物傳感器中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的知情同意書。收集研究對象晨起第一次尿液樣本,不添加蛋白酶抑制劑及防腐劑,2小時(shí)內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室處理。2.“液壓透析法”尿exosomes的分離、富集尿液標(biāo)本先室溫下2000g離心30分鐘,除去細(xì)胞、細(xì)胞碎片、及部分Tamm-Horsfall蛋白。一上清液通過自行設(shè)計(jì)的液壓透析裝置進(jìn)行exosomes分離、富集：檢查裝置連接良好后,將尿液標(biāo)本倒入該裝置,待樣品濃縮至6-8ml時(shí),加入200ml miliQ水,沖洗1000KD透析膜。待樣品進(jìn)一步濃縮至6-8ml時(shí)收集1000KD透析膜內(nèi)的液體(↑1000KDa fraction).3.尿exosomes的鑒定透射電子顯微鏡觀察“液壓透析法”分離、富集的1、1000KDa部分液體中是否存在囊泡,囊泡的形狀、大小。通過western blot檢測尿exosomes自身的標(biāo)記物TSG1O1。4.探討尿液exosomes相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)化(量化)指標(biāo)探討Tamm-Horsfall蛋白以及白蛋白這兩種指標(biāo)在尿液exosomes相關(guān)檢測結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化的應(yīng)用可行性。10位健康人尿液“液壓透析法”富集的尿液exosomes樣品(↑1000KDa),通過western blot技術(shù)在同一塊膜上檢測Tamm-Horsfall 蛋白與TSG101蛋白熒光信號(hào)以及白蛋白與TSG101蛋白熒光信號(hào),利用Odyssey掃描系統(tǒng)自帶的軟件定量分析熒光信號(hào)強(qiáng)度。使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包對10份樣品的灰度值數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。應(yīng)用Spearman秩相關(guān)系數(shù)來分析THP與TSG101灰度值,以及Albumin與TSGIO1灰度值之間的相關(guān)關(guān)系,以p0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5.還原與烷基化反應(yīng)對尿液exosomes外部干擾蛋白的去除Tamm-Horsfall蛋白的多聚體結(jié)構(gòu)中富含二硫鍵。利用還原與烷基化試劑對二硫鍵破壞,觀察其對尿液exosoems外部干擾蛋白(特別是Tamm-Horsfall蛋白的降解與清除情況)以及對exosomes的影響,為exosomes的純化研究提供指導(dǎo)。6. Trypsin酶解反應(yīng)對尿液exosomes外部干擾蛋白的去除及exosomes的純化對尿液“液壓透析法”富集的尿液exosomes樣品(↑1000KDa)進(jìn)行還原、烷基化及蛋白酶Trypsin酶解反應(yīng)。將外部的蛋白(特別是Tamm-Horsfall蛋白)分解成肽段,再經(jīng)過截留分子量為30KD的超濾裝置進(jìn)行分離。利用凝膠考馬斯亮藍(lán)染色、western blot及透射電鏡觀察Tamm-Horsfall蛋白的分解及清除情況,以及對exosomes本身的影響。7.在尿液exosomes純化的基礎(chǔ)上對exosomes內(nèi)部蛋白指紋圖譜的分析對尿液“液壓透析法”富集的尿液exosomes樣品,利用上述方法進(jìn)行exosomes純化。然后使用去污劑脫氧膽酸鈉破壞exosomes外膜,暴露exosomes內(nèi)部成分,再進(jìn)行還原、烷基化及Trypsin酶解蛋白,利用質(zhì)譜分析了解exosomes內(nèi)部蛋白指紋圖譜。結(jié)果1.新型尿液exosomes分離、富集技術(shù)的驗(yàn)證中國人群不同腎臟病變程度尿液樣品通過“液壓透析法”均可有效分離、富集exosomes,體現(xiàn)了很好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。透射電鏡下可以觀察到↑1OOOKDa樣品中散在分布的大小不等的囊泡,囊泡主要的直徑范圍為40-1 OOnrn,最小的囊泡直徑為20-30nm,最大的囊泡直徑可為400nm 。 Western blot檢測到exosomes自身的標(biāo)記物TSG101陽性,表明尿exosomes富集過程中exosomes未受到破壞。2.尿液exosomes相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)化(量化)指標(biāo)通過Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描后的圖像通過Quantity-One圖像分析軟件掃描計(jì)算出條帶平均灰度值。Spearman秩相關(guān)系數(shù)的分析結(jié)果顯示Tamm-Horsfall蛋白與TSG101熒光強(qiáng)度相關(guān)系數(shù)r=0.842,p=0.002,兩者之間具有正相關(guān)關(guān)系。3.還原與烷基化反應(yīng)對尿液exosomes外部干擾蛋白的去除凝膠考馬斯亮藍(lán)染色及western blot結(jié)果顯示,還原與烷基化反應(yīng)后exosomes外Tamm-Horsfall蛋白部分降解,但兩種還原及烷基化試劑在不同速度離心下均不能完全消除Tamm-Horsfall蛋白對exosomes的影響。4.Trysin酶解反應(yīng)對尿液exosomes外部干擾蛋白的去除及exosomes的純化凝膠考馬斯亮藍(lán)染色及western blot結(jié)果顯示,還原、烷基化基礎(chǔ)上的Trypsin酶解反應(yīng),可將exosomes外Tamm-Horsfall蛋白完全降解。通過截留分子量為30KD的超濾裝置可清除已降解的肽段,實(shí)現(xiàn)exosomes的純化。整個(gè)過程中exosomes未受到破環(huán)。5.在尿液exosomes純化的基礎(chǔ)上對exosomes內(nèi)部蛋白指紋圖譜的分析在上述純化的exosomes的基礎(chǔ)上,對exosomes內(nèi)部成分進(jìn)行MS/MS分析,結(jié)果共鑒定出exosomes內(nèi)部942種蛋白質(zhì)并對鑒定的蛋白進(jìn)行了細(xì)胞組分、分子功能與生物過程的分析。結(jié)論1.本研究團(tuán)隊(duì)所發(fā)明的“液壓透析法”能夠很好地分離、富集尿液中的exosomes有著良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性,適用于不同的實(shí)驗(yàn)室、不同的人群以及不同的尿液病理狀態(tài),是一種值得廣泛推廣應(yīng)用的技術(shù)方法。2.Tamm-Horsfall蛋白可以作為檢測尿液exosomes相關(guān)生物標(biāo)記物的候選標(biāo)準(zhǔn)化(量化)指標(biāo)。3.應(yīng)用還原、烷基化及Trypsin酶解反應(yīng)結(jié)合超濾裝置能實(shí)現(xiàn)尿液exosomes的純化,再此基礎(chǔ)上鑒定可靠的exosomes內(nèi)部蛋白質(zhì)圖譜。4.本研究建立了一套從尿液收集,到尿液exosomes分離、富集、純化及蛋白質(zhì)組學(xué)分析的一體化研究方法,為后續(xù)的疾病尿液exosomes生物標(biāo)記物研究提供了指導(dǎo)。
【關(guān)鍵詞】：尿液exosomes Tamm-Horsfall蛋白 還原反應(yīng) 烷基化反應(yīng) 酶解反應(yīng) 蛋白質(zhì)組學(xué) 質(zhì)譜分析
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R446.12
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-21
• 前言21-30
• 第一章 新型尿液exosomes分離、富集技術(shù)的驗(yàn)證30-47
• 1. 材料與方法30-38
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器30-32
• 1.2 研究方法32-38
• 2. 結(jié)果38-45
• 2.1 蛋白濃度38-40
• 2.2 SDS-PAGE凝膠電泳后銀染及Western blot結(jié)果40-43
• 2.3 透射電鏡43-45
• 3. 討論45-47
• 第二章 尿液exosomes標(biāo)準(zhǔn)化(量化)指標(biāo)探討47-61
• 1. 材料與方法47-53
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器47-49
• 1.2 研究方法49-53
• 2 結(jié)果53-58
• 2.1 Tamm-Horsfall蛋白與TSG101熒光條帶灰度值相關(guān)性53-55
• 2.2 Albumin與TSG101熒光條帶灰度值相關(guān)性55-58
• 3 討論58-61
• 第三章 尿液exosomes外部干擾蛋白去除及其純化61-88
• 第一節(jié) 不同還原劑與烷化劑對exosomes外干擾蛋白特別是THP的影響61-77
• 1 材料與方法63-70
• 2 結(jié)果70-76
• 3 討論76-77
• 第二節(jié) 還原與烷基化反應(yīng)基礎(chǔ)上的Trypsin酶解對exosomes外干擾蛋白的清除以及exosomes的純化77-88
• 1 材料與方法78-84
• 2 結(jié)果84-86
• 3 討論86-88
• 第四章 在尿液exosomes純化的基礎(chǔ)上對exosomes內(nèi)部蛋白指紋圖譜的分析88-103
• 1 材料與方法88-94
• 2 結(jié)果94-101
• 3 討論101-103
• 參考文獻(xiàn)103-110
• 附錄1 英文縮略詞對照表110-112
• 附錄2 所發(fā)表的SCI論文112-150
• 攻讀學(xué)位期間成果150-154
• 致謝154-155

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本文編號(hào)：993708