本文關(guān)鍵詞：基于量子點的Ki67,CK多光譜成像在乳腺癌中的研究

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【摘要】：[背景]乳腺癌(breast cancer, BC),是當(dāng)今世界上女性最常見的惡性腫瘤之一。腫瘤是一種高度異質(zhì)性的疾病,其在不同的患者同一階段具有不同的生物學(xué)行為,這已成為腫瘤界的共識。通過近年來長期對乳腺癌的分子生物學(xué)機制的研究,基于不同腫瘤分子分型的個體化治療已經(jīng)成為乳腺癌治療的主要方向。個性化醫(yī)療的前提是正確理解預(yù)后和預(yù)測參數(shù),這仍然是目前乳腺癌治療方面非常重要且熱門的研究領(lǐng)域。隨著分子生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展,科學(xué)家們探討了眾多乳腺癌相關(guān)分子的預(yù)后作用,臨床實踐中最常用的指標(biāo)包括人類表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor-2, HER2),雌激素受體(estrogen receptor, ER),孕激素受體(progesterone receptor, PR)和Ki67。其中,Ki67,一種上世紀(jì)80年代初發(fā)現(xiàn)的抗原,已被報道與乳腺癌的預(yù)后密切相關(guān)。Ki67是一種核內(nèi)抗原,最初在上世紀(jì)80年代初由Gerdes等證實。Gerdes通過對霍奇金淋巴瘤細(xì)胞系核抗原進(jìn)行免疫獲得了小鼠Ki67的單克隆抗體。由于當(dāng)時的實驗地點是在德國Kiel大學(xué),該克隆的獲得位置是96孔板的第67位,因此命名為Ki67。Ki67在細(xì)胞周期的不同時期表達(dá)不盡相同。在細(xì)胞周期的G1,S,G2,和有絲分裂的M期均有Ki67的表達(dá),其中在G1和S期表達(dá)水平較低,但在有絲分裂期表達(dá)水平達(dá)到峰值,隨著有絲分裂進(jìn)入后期(后期和末期),Ki67水平急劇下降,而在GO期無表達(dá)。Ki67作為使用最廣泛的增殖標(biāo)記物,近年來由于其在預(yù)后方面的預(yù)測作用吸引了越來越多的目光。許多研究表明,Ki67的表達(dá)水平與乳腺癌預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。然而,到目前為止,由于Ki67高表達(dá)指數(shù)的臨界值定義不一致,而且檢測技術(shù)也不盡相同,導(dǎo)致各研究結(jié)果的基線不完全一致,很難做出準(zhǔn)確又客觀的判斷。界定的不同必將導(dǎo)致Ki67指數(shù)的不同,因此對預(yù)后的預(yù)測差異較大,大大限制了其在臨床上的應(yīng)用。雖然近年來Ki67自動計數(shù)軟件逐漸發(fā)展起來,為臨床檢測帶來巨大方便,但是到目前為止還沒有證據(jù)表明它比人工計數(shù)更好,更準(zhǔn)確。此外,最終通過傳統(tǒng)的計算機軟件獲得的結(jié)果是Ki67表達(dá)的總數(shù),而不是Ki67表達(dá)百分比(受腫瘤細(xì)胞總數(shù)的影響)。因此,迫切需要發(fā)展一種更為準(zhǔn)確和客觀評價乳腺癌中Ki67表達(dá)的方法。量子點(quantum dots, QDs)是具有獨特尺寸和表面效應(yīng)的熒光納米顆粒。由于其優(yōu)良的性能被廣泛應(yīng)用于生物成像,定位和檢測。量子點的明顯優(yōu)勢包括：熒光強度高,抗光漂白,化學(xué)降解強,尺寸可調(diào)的發(fā)射波長和在單光源激發(fā)光下同時發(fā)射多種熒光光譜。在本研究中,我們旨在建立一個基于量子點的Ki67、細(xì)胞角蛋白(cytokeratin, CK,本研究中一種用于標(biāo)記腫瘤細(xì)胞的上皮特異性標(biāo)記物)定量和原位多光譜成像,以便更好地評估其對乳腺癌預(yù)后的影響。為了更準(zhǔn)確、客觀地評價Ki67的表達(dá),Ki67/CK值將被用來代替Ki67百分比。[目的]本研究的目的是運用量子點多光譜成像技術(shù)開發(fā)基于熒光光譜的Ki67和細(xì)胞角蛋白的定量及原位、實時、同時成像,評估其對乳腺癌預(yù)后的影響。[方法]我們的腫瘤中心建立了一個全面的乳腺癌數(shù)據(jù)庫。在本研究中我們通過5年隨訪收集了240例乳腺癌樣本(480個芯片,每個芯片直徑1.5毫米).每位患者都建立了詳盡的臨床病理資料,包括年齡,絕經(jīng)狀態(tài),T分期,N分期,組織學(xué)分級,ER和HER2基因表達(dá)水平等。基于我們系統(tǒng)建立的數(shù)據(jù)庫,ER和HER2水平的檢測是由臨床實驗室的病理專家遵循最新的病理學(xué)指導(dǎo)完成的：通過免疫組化(IHC)檢測ER水平,熒光原位雜交(fluorescent in-situ hybridization, FISH)檢測HER2水平。我們建立了一種基于量子點的原位多光譜熒光成像方法,Ki67免疫染色使用Ki67單克隆兔抗,使用生物素化標(biāo)記的抗兔IgG和鏈霉親和素偶聯(lián)的QDs-605可以使細(xì)胞核發(fā)出Ki67的紅色熒光。用抗小鼠的CK單克隆抗體進(jìn)行CK免疫組化染色,羊抗小鼠IgG與QDs-525用于在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)出CK的綠色熒光,每個芯片通過同時拍攝6張圖像獲取Ki67和CK量子點熒光信息。為了驗證上述成像技術(shù)以及比較乳腺癌中不同成像方法的技術(shù)特點,我們對三種成像方法進(jìn)行了直接比較,即常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色,Ki67和CK分別免疫組化染色,基于量子點的CK和Ki67同時多光譜成像。采集圖像后,Ki67和CK的分離和定量借助于CRi Nuance多光譜成像系統(tǒng)。我們獲得了每一位患者的Ki67和CK值,以及Ki67/CK值。下一步X-tile軟件將會發(fā)揮作用,主要通過結(jié)果來評估生物標(biāo)記物并尋求最佳截點,自動判斷Ki67總值和Ki67/CK值的截點,并將其分為兩類,設(shè)定為Ⅰ級和Ⅱ級。我們使用SPSS 17.0軟件對收集到的實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析,利用皮爾森卡方檢定對類別變量進(jìn)行相關(guān)性的檢驗。用Kaplan-Meier生存曲線和log-rank檢驗分析五年無病生存期(five-year disease free survival,5-DFS)與各因素的關(guān)系。通過Cox多因素風(fēng)險比例模型進(jìn)行多因素分析。采用受試者工作特征曲線(ROC)分析法計算獨立預(yù)后因子的預(yù)測值。[結(jié)果]我們首先比較了乳腺癌不同成像方法的技術(shù)特點。HE染色可以顯示腫瘤的組織結(jié)構(gòu),腫瘤細(xì)胞侵入基質(zhì)形成癌巢,但圖像難以區(qū)分腫瘤與基質(zhì),不能明確顯示腫瘤巢的侵襲邊緣。免疫組化染色只能標(biāo)記清楚Ki67,但不能清楚顯示癌巢,因此很難在技術(shù)上精確量化癌巢Ki67百分比。同樣,對CK進(jìn)行免疫組化染色可以標(biāo)記清楚癌巢,但不能標(biāo)記Ki67。相比之下,量子點對CK和Ki67的多分子成像可以同時標(biāo)記Ki67和癌巢,可以根據(jù)CK和Ki67清晰區(qū)分癌巢及基質(zhì)。基于量子點同時對核中的Ki67和細(xì)胞質(zhì)中CK染色可形成鮮明的信號對比,便于信號的分離和定量。基于最佳P值原理的X-tile軟件采用5-DFS進(jìn)行預(yù)測,自動設(shè)定Ki67總值和Ki67/CK值的截點分別為3.58×107和0.186�；谝陨辖攸c,Ki67和Ki67/CK各分為兩級。我們隨后觀察了乳腺癌中Ki67的表達(dá)模式。Ki67表達(dá)水平的高低與增殖無關(guān),而Ki67陽性表達(dá)率與增殖活性呈正相關(guān)。Ki67主要表達(dá)于癌細(xì)胞的細(xì)胞核,很少表達(dá)于基質(zhì),從不表達(dá)于血管。Ki67在浸潤導(dǎo)管癌癌巢中表達(dá)水平較高而在原位癌的癌巢中表達(dá)相對較低。對于原位癌,Ki67顯著表達(dá)于癌巢周圍,癌巢中心相對較少。對于浸潤性癌Ki67的表達(dá)較無序,我們在在雜亂無章的癌巢中可觀察到Ki67的表達(dá)。Ki67在微創(chuàng)原位癌以及浸潤性導(dǎo)管癌的癌巢侵襲邊緣具有較高的表達(dá)水平。當(dāng)一個大的瘤巢產(chǎn)生較小的種植瘤巢,兩癌巢間的連接處Ki67表達(dá)較高。Ki67的等級在總體患者以及淋巴結(jié)陽性患者中與5-DFS呈負(fù)相關(guān),但在淋巴結(jié)陰性組與5-DFS無相關(guān)性。Ki67/CK等級在總體患者,淋巴結(jié)陰性組,淋巴結(jié)陽性組與5-DFS均呈負(fù)相關(guān)。然后將已通過Kaplan-Meier生存分析驗證過的Ki67等級或Ki67/CK等級和傳統(tǒng)的預(yù)后指標(biāo)進(jìn)行COX比例風(fēng)險模型分析。Ki67/CK分級的危險比(HR)(HR 2.019,95% CI[1.254-3.251])高于N分期(HR 1.819,95% CI[1.501-2.204])和HER2基因(HR 1.748,95% CI [1.087-2.812]),但低于組織學(xué)分級(HR 3.370,95 CI為[1.125-5.364]).此外,Ki67/CK分級的重要性和風(fēng)險比(HR)(P=0.004;HR 2.019,95% CI[1.254-3.251])高于Ki67分級(P=0.047;HR 1.773,95% CI[1.009-3.117]).此外,ROC分析Ki67/CK分級曲線下面積(AUC)(AUC:0.683,95% CI:0.613-0.752)高于Ki67分級(AUC:0.665,95% CI:0.596-0.734)和HER-2基因(AUC:0.586,95% CI:0.510-0.661),但低于N分期(AUC:0.760,95% CI:0.696-0.823)和組織學(xué)分級(AUC:0.756,95% CI:0.692-0.820).[結(jié)論]本研究基于量子點的多分子成像技術(shù)探討了Ki67和CK在乳腺癌組織中的表達(dá),證實了Ki67/CK分級是一個預(yù)測乳腺癌預(yù)后優(yōu)于Ki67分級的預(yù)后因素。
【關(guān)鍵詞】：乳腺癌 量子點 Ki67 CK Ki67/CK
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 中文摘要7-11
• Abstract11-16
• 縮略詞16-17
• 前言17-20
• 材料方法20-32
• 結(jié)果32-48
• 討論48-51
• 總結(jié)51-52
• 創(chuàng)新點52-53
• 參考文獻(xiàn)53-63
• 綜述63-82
• 參考文獻(xiàn)73-82
• 附錄一 240例乳腺癌患者臨床病理特征、Ki67值、CK值、Ki67/CK值一覽表82-97
• 附錄二 已發(fā)表科研論文97-99
• 附錄三 會議論文99-100
• 附錄四 科研獎勵100
• 附錄五 專著100-101
• 致謝101

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