本文關(guān)鍵詞：p38MAPK在GERD發(fā)生發(fā)展過程中的作用和機(jī)制研究

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【摘要】：研究背景和目的：近年來,隨著社會生活節(jié)奏的加快和人們作息、飲食習(xí)慣的改變,我國胃食管反流病(Gastroesophageal reflux diseases, GERD)發(fā)病率日益增高。GERD嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量,耗費(fèi)大量衛(wèi)生資源,對其發(fā)病機(jī)制的探索一直是本領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。GERD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,可能與防御因素和侵襲因素的不平衡有關(guān)。根據(jù)內(nèi)鏡結(jié)果可分為反流性食管炎(Reflux esophagitis,簡稱RE)和非糜爛性反流病(Non-erosive reflux disease,簡稱NERD)兩種類型。目前GERD的治療仍以質(zhì)子泵抑制劑為主,但即使是足劑量足療程,仍有40%的患者治療失敗,而且有效的病例多需要長期服藥。有效治療方法的缺失推動著研究者對其發(fā)病機(jī)制的深入探索及新治療手段的開發(fā)。絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,簡稱MAPKs)作為一類絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶,在細(xì)胞內(nèi)的參與了細(xì)胞分化、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、器官發(fā)育和內(nèi)臟高敏感等多方面的作用。p38 MAPK通路作為MAPK通路之一,Toll樣受體、TNF-α、IL-1、熱休克、脂多糖及缺氧等細(xì)胞刺激等因素可活化p38 MAPK,而p38 MAPK活化可上調(diào)TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等,從而誘發(fā)炎癥反應(yīng)。本課題的研究目的是探討p38 MAPK通路在GRED發(fā)病過程中作用和地位。實(shí)驗(yàn)方法：第一部分：原代培養(yǎng)人食管上皮細(xì)胞,給予酸刺激(pH5.0)15分鐘,觀察p38 MAPK通路的變化；人食管上皮細(xì)胞給予p38 MAPK抑制劑SB203580進(jìn)行預(yù)處理治療,然后給予酸刺激(48小時內(nèi)進(jìn)行7次,每次持續(xù)15分鐘),從炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)性一氧化氮合酶／一氧化氮通路、上皮緊密連接功能蛋白三個角度探討p38 MAPK在酸刺激誘導(dǎo)的食管上皮細(xì)胞損傷過程中的作用。第二部分：原代培養(yǎng)人食管上皮細(xì)胞,給予胰蛋白酶刺激,觀察p38 MAPK通路的變化；人食管上皮細(xì)胞給予p38 MAPK抑制劑SB203580進(jìn)行預(yù)處理治療,然后給予胰蛋白酶刺激(48小時內(nèi)進(jìn)行3次,每次持續(xù)4小時),從炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)性一氧化氮合酶／一氧化氮通路、上皮緊密連接功能蛋白三個角度探討p38 MAPK在胰蛋白酶刺激誘導(dǎo)的食管上皮細(xì)胞損傷過程中的作用。第三部分：胃底結(jié)扎加幽門限制法誘導(dǎo)形成反流性食管炎(RE)模型,2周后,觀察大鼠食管上皮中p38 MAPK通路的變化；給予p38 MAPK抑制劑SB203580進(jìn)行治療,2周后,檢測胃內(nèi)容物的酸堿度；大體觀察和伊紅蘇木素染色觀察食管的病變程度；考察食管上皮的屏障功能,檢測食管組織中緊密連接功能蛋白的表達(dá)；檢測食管組織中基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)；CD68免疫染色考察食管上皮組織中炎性細(xì)胞的侵潤程度,考察組織和血清中炎癥因子的表達(dá)水平；考察食管組織中iNOS蛋白表達(dá)水平和NO產(chǎn)物含量。通過這些檢測最終考察p38MAPK在胃底結(jié)扎加幽門限制法誘導(dǎo)形成反流性食管炎中的作用和地位。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：第一部分：1)酸刺激15mmin后,食道上皮細(xì)胞中p38 MAPK的磷酸化程度隨著酸pH值的下降而增加。結(jié)果提示酸刺激可以激動食道上皮細(xì)胞的p38 MAPK信號通路。2)酸刺激后,食道上皮細(xì)胞中IL-8, COX2, TNFa的mRNA水平明顯增加；給予p38MAPK抑制劑SB203580進(jìn)行預(yù)處理治療干預(yù),發(fā)現(xiàn)可以明顯降低食道上皮細(xì)胞中IL-8, COX2, TNFa的mRNA水平。3)酸刺激后,食道上皮細(xì)胞中iNOS蛋白表達(dá)增加,NO水平增加；給予p38 MAPK抑制劑SB203580進(jìn)行預(yù)處理治療干預(yù),發(fā)現(xiàn)可以明顯降低食道上皮細(xì)胞中iNOS蛋白表達(dá)和NO水平。4)酸刺激后,食道上皮細(xì)胞中claudin-1、occludin、ZO-1的mRNA水平明顯降低。給予p38 MAPK抑制劑SB203580預(yù)處理治療,claudin-1、occludin、ZO-1的mRNA水平明顯增加。第二部分：1)胰蛋白酶刺激4小時后,食道上皮細(xì)胞中p38 MAPK的磷酸化程度隨著胰蛋白酶劑量的增加而增加。結(jié)果提示胰蛋白酶刺激激動了食道上皮細(xì)胞的p38 MAPK信號通路。2)胰蛋白酶刺激后,食道上皮細(xì)胞中IL-8,COX2,TNFα的mRNA水平明顯增加；給予p38 MAPK抑制劑SB203580進(jìn)行預(yù)處理治療干預(yù),發(fā)現(xiàn)可以明顯降低食道上皮細(xì)胞中IL-8,COX2,TNFα的mRNA水平。胰蛋白酶刺激后,食道上皮細(xì)胞中iNOS蛋白表達(dá)增加,NO水平增加；給予p38 MAPK抑制劑SB203580進(jìn)行預(yù)處理治療干預(yù),發(fā)現(xiàn)可以明顯降低食道上皮細(xì)胞中iNOS蛋白表達(dá)和NO水平。3)胰蛋白酶刺激后,食道上皮細(xì)胞中claudin-1和ZO-1的mRNA水平明顯增加,而occludin的mRNA水平?jīng)]有明顯變化；給予p38 MAPK抑制劑SB203580進(jìn)行預(yù)處理治療干預(yù),發(fā)現(xiàn)可以明顯增加食道上皮細(xì)胞中claudin-1和ZO-1的mRNA水平。第三部分：1)胃底結(jié)扎加幽門限制法誘導(dǎo)形成反流性食管炎(RE)模型,2周后,免疫組化和Western blotting分析發(fā)現(xiàn),RE大鼠食管上皮組織中p38MAPK磷酸化水平明顯增加,給予其抑制劑SB203580治療,可以降低RE大鼠食管上皮組織中p38MAPK磷酸化水平。2)胃底結(jié)扎加幽門限制法誘導(dǎo)形成反流性食管炎(RE)模型,2周后,RE大鼠胃內(nèi)容物的pH明顯降低,而p38MAPK抑制劑SB203580治療對之沒有明顯影響。術(shù)后2周后,RE實(shí)驗(yàn)組大鼠食管組織出現(xiàn)明顯的出血和腐蝕病變,HE染色可見鱗狀上皮基底細(xì)胞層增厚,乳頭向上皮腔面延長,炎性細(xì)胞浸潤,鱗狀上皮氣球樣變；給予p38MAPK抑制劑SB203580治療可以明顯減輕食管組織的病變。3)RE模型2周后,RE大鼠食管上皮組織中claudin-1蛋白表達(dá)明顯降低;上皮跨膜電阻抗(transepithelial electrical resistance, TER)明顯降低,提示RE大鼠食管上皮的屏障功能明顯下降。另外,RT-PCR結(jié)果顯示RE大鼠食管組織中occludin和ZO-1的mRNA水平明顯降低。給予p38MAPK抑制劑SB203580治療后,RE大鼠食管上皮中claudin-1蛋白表達(dá)增加,跨膜電阻抗增加,occludin和ZO-1的mRNA水平明顯。4)RE模型2周后,免疫組化結(jié)果顯示RE大鼠食管上皮組織中基質(zhì)金屬蛋白酶3和9(matrix metalloproteinase, MMP)的蛋白表達(dá)水平明顯增加；給予p38MAPK抑制劑SB203580治療后,RE大鼠食管上皮中MMP3和MMP9蛋白表達(dá)明顯降低。5)RE模型2周后,免疫組化結(jié)果顯示RE大鼠食管上皮組織中CD68表達(dá)明顯增加,提示上皮組織中炎性細(xì)胞侵潤增加；RT-PCR結(jié)果顯示RE大鼠食管組織中TNFα、 IL-6、IL-1β的mRNA水平明顯增加,而ELISA結(jié)果顯示RE大鼠血清中TNFα、 IL-6、IL-1β的蛋白水平明顯增加。給予p38MAPK抑制劑SB203580治療后,RE大鼠食管上皮中炎性細(xì)胞侵潤減少(CD68表達(dá)降低),組織中TNFα、IL-6、IL-1β的mRNA水平明顯降低,血清中TNFα、IL-6、IL-1β的蛋白水平明顯降低。6)RE模型2周后,RE大鼠食管組織中誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)蛋白表達(dá)水平明顯增加,組織中一氧化氮(nitric oxide, NO)產(chǎn)物水平明顯增加,3-硝基絡(luò)氨酸水平明顯增加。給予p38MAPK抑制劑SB203580治療后,RE大鼠食管iNOS蛋白表達(dá)降低,NO生成減少,3-硝基絡(luò)氨酸水平降低。結(jié)論：在胃食管反流病中,胰蛋白酶和酸是通過激活p38 MAPK通路,誘發(fā)炎癥,激動iNOS/NO,從而造成食道黏膜上皮細(xì)胞的炎性損傷。本研究從p38 MAPK通路闡述了胃食管反流病中食道黏膜損傷的潛在機(jī)制,為治療反流性食道炎提供了一個嶄新的靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：p38絲裂原活化蛋白激酶 胃食管反流病 跨膜電阻抗 誘導(dǎo)性一氧化氮合酶
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R571
【目錄】：

• 摘要6-10
• ABSTRACT10-13
• 英文縮略詞表13-15
• 前言15-18
• 第一部分 P38 MAPK在酸刺激誘導(dǎo)的人食道黏膜上皮細(xì)胞損傷過程中的作用18-35
• 材料與方法18-30
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-34
• 小結(jié)34-35
• 第二部分 P38 MAPK在胰蛋白酶刺激誘導(dǎo)的人食道黏膜上皮細(xì)胞損傷過程中的作用35-52
• 材料與方法35-47
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果47-51
• 小結(jié)51-52
• 第三部分 p38 MAPK通路在慢性反流性食管炎模型大鼠中的作用和意義52-80
• 材料與方法53-73
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果73-79
• 小結(jié)79-80
• 討論80-83
• 結(jié)論83-84
• 參考文獻(xiàn)84-92
• 綜述92-103
• 參考文獻(xiàn)98-103
• 在讀期間發(fā)表論文和參加科研工作103-104
• 致謝104

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本文編號：978724