本文關(guān)鍵詞：靜電紡絲納米纖維支架誘導(dǎo)iPS細胞心肌分化及機制研究

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【摘要】：【研究背景】在世界范圍內(nèi),特別是在我國及主要發(fā)達國家,心血管疾病已經(jīng)成為導(dǎo)致患者死亡的首要病因。心臟衰竭、慢性缺血性心肌病與急性心肌梗死是其中三種最常見的死亡原因。到目前為止,臨床上對于因功能性心肌細胞損失過多所導(dǎo)致的終末期心臟衰竭,除了心臟移植之外還沒有確切的治療方法。由于供體稀缺和免疫排斥等相關(guān)問題,心血管疾病的治療迫切需要新方法,而基于干細胞和組織工程技術(shù)的組織器官再生將是未來研究發(fā)展的重點方向。心肌再生需要有種子細胞生成大量同源心肌細胞,這一點已經(jīng)逐漸成為學(xué)者及臨床醫(yī)生們的共識。在各種干細胞中,誘導(dǎo)多能干細胞(induced pluripotent stem cell,i PSC)被認為是最理想的種子細胞來源。而作為種子細胞生長分化的載體,材料支架是另一至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。心肌細胞(Cardiomyocyte,CM)生長在細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)的環(huán)繞之中,而靜電紡絲納米纖維支架能夠做到結(jié)構(gòu)高度類似于天然ECM,從而能夠在體外為種子細胞生長分化提供適宜的物理微環(huán)境。早期為了解決i PSC向CM分化的效率問題,大多研究集中在使用細胞因子對干細胞進行高效誘導(dǎo)定向分化,應(yīng)用仿生支架構(gòu)建人工心肌方面研究很少。在為數(shù)不多的人工心肌構(gòu)建方面的當研究中,大多研究采用的是已分化完成的CMs來與支架共培養(yǎng),另一些研究則考慮如何將ECM的成份制作為支架或添加到材料支架內(nèi)以用于CMs的負載培養(yǎng),而對于仿生納米纖維支架的物理微環(huán)境對于i PSC向CMs分化的作用尚不清楚。支架對干細胞心肌方向分化的影響或作用,正是構(gòu)建組織工程心肌亟需了解的問題�！灸康摹垦芯咳S納米纖維仿生支架的物理微環(huán)境對i PSC向CM分化的影響及其機制,為組織工程心肌支架構(gòu)建提供理論依據(jù)�！痉椒ā�1)采用靜電紡絲技術(shù)生產(chǎn)聚己內(nèi)酯(Poly-(ε-caprolactone),PCL)納米纖維,構(gòu)建具備三維結(jié)構(gòu)的納米纖維仿生支架。2)評價支架的各項理化性質(zhì),并與小鼠胚胎成纖維細胞共培養(yǎng)以評價支架的安全性及細胞相容性。3)攜帶GFP轉(zhuǎn)基因的Oct4-GFP+小鼠誘導(dǎo)多能干細胞(murine induced pluripotent stem cell,mi PSC)負載到納米纖維仿生支架上共培養(yǎng),熒光顯微鏡直接追蹤觀察mi PSCs的生長及多能性維持情況,并評估支架用于mi PSC培養(yǎng)的可行性。4)采用單層法(monolayer method)將Oct4-GFP+mi PSCs直接粘附培養(yǎng)在PCL三維納米纖維支架上,不添加分化誘導(dǎo)劑自發(fā)分化,探討PCL納米纖維支架對mi PSC向CM分化可能的影響。5)提取總蛋白與不同時間點總m RNA,比較PCL納米纖維支架與無支架培養(yǎng)對mi PSCs向CM分化的影響,探討其影響因素。6)特異性調(diào)節(jié)細胞分化不同階段的Wnt/β-catenin信號活性,探討三維PCL納米纖維支架影響分化可能的分子機制�！窘Y(jié)果】1)靜電紡絲技術(shù)成功制得光滑連續(xù),直徑為納米級別的PCL纖維和PCL/gelatin復(fù)合型纖維,并成功構(gòu)建出孔隙結(jié)構(gòu)豐富的三維立體納米纖維仿生支架。2)PCL與明膠成份混紡或直接在纖維表面包被明膠,均可以克服材料原有的不利屬性,提高細胞親和粘附能力,證實這種處理后的PCL納米纖維支架具備良好的細胞相容性,適合生物組織工程應(yīng)用。3)帶有綠色熒光蛋白標記物的Oct4-GFP+mi PSCs在PCL納米纖維支架上單獨培養(yǎng),一定時間內(nèi)能夠保持細胞干性標志物表達,表明PCL納米纖維支架可用作基底用于mi PSC的自我更新擴增培養(yǎng)。4)單層法培養(yǎng)mi PSC于PCL納米纖維支架上,發(fā)現(xiàn)mi PSC直接粘附PCL納米纖維后,不添加外源性誘導(dǎo)因子情況下也能夠自發(fā)性分化出CM。5)三維PCL納米纖維的這種促心肌細胞分化的作用明顯強于2D培養(yǎng)皿,這種作用與其表面獨特物理結(jié)構(gòu)的微觀形貌具有密切關(guān)系。6)選擇性激動劑和抑制劑調(diào)節(jié)細胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號通路,證實這種納米纖維支架通過調(diào)節(jié)mi PSCs內(nèi)的Wnt/β-catenin信號從而促進CM的分化。綜上所述,可以得出結(jié)論,三維PCL納米纖維仿生支架不僅可用于mi PSC擴增培養(yǎng),而且可通過其提供的物理生物信號調(diào)節(jié)細胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號活性從而促進mi PSC向心肌細胞的分化。
【關(guān)鍵詞】：誘導(dǎo)多能干細胞 細胞分化 心肌細胞 聚己內(nèi)酯 靜電紡絲 納米纖維支架 Wnt/β-catenin信號 機制
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R54
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-13
• 前言13-15
• 文獻回顧15-30
• 實驗一 納米纖維支架的構(gòu)建及其性質(zhì)研究30-50
• 1 材料31-32
• 2 方法32-35
• 3 結(jié)果35-45
• 4 討論45-50
• 實驗二 納米纖維支架誘導(dǎo)MIPSC向心肌細胞分化50-72
• 1 材料50-52
• 2 方法52-61
• 3 結(jié)果61-69
• 4 討論69-72
• 實驗三 納米纖維支架促進MIPSC向心肌細胞分化的機制探討72-92
• 1 材料72-75
• 2 方法75-80
• 3 結(jié)果80-88
• 4 討論88-92
• 小結(jié)92-94
• 參考文獻94-105
• 個人簡歷和研究成果105-106
• 致謝106-107

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本文編號：981056