發(fā)布時(shí)間：2017-10-04 06:24

  本文關(guān)鍵詞：ClC-2氯通道在糖尿病難愈性創(chuàng)面表皮干細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)中的作用和機(jī)制

  更多相關(guān)文章： 糖尿病難愈性創(chuàng)面 高糖培養(yǎng) 表皮干細(xì)胞 Cl C-2 容積敏感型氯電流 細(xì)胞遷移

【摘要】：糖尿病難愈性創(chuàng)面是糖尿病患者除全身系統(tǒng)性疾病外發(fā)生的一種常見(jiàn)的、嚴(yán)重的局部并發(fā)癥。引起糖尿病創(chuàng)面延遲愈合的原因也是多方面的,局部創(chuàng)面再上皮化進(jìn)程的破壞可導(dǎo)致創(chuàng)面的延遲愈合。很多糖尿病創(chuàng)面經(jīng)傳統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)處理后并沒(méi)有取得良好的療效。細(xì)胞療法是治療糖尿病難愈性創(chuàng)面的一種很有發(fā)展遠(yuǎn)景的治療手段。無(wú)論是急性還是慢性創(chuàng)面,實(shí)現(xiàn)再上皮化對(duì)創(chuàng)面的封閉和愈合至關(guān)重要。而在急性創(chuàng)面的再上皮化進(jìn)程中扮演著關(guān)鍵角色的表皮干細(xì)胞在慢性創(chuàng)面包括糖尿病創(chuàng)面的愈合方面卻沒(méi)有發(fā)揮相似的作用。皮膚的自我更新及自穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)有賴于功能正常的表皮干細(xì)胞的存在。當(dāng)皮膚受到損傷后,干細(xì)胞開始分裂成姐妹細(xì)胞并遷移到創(chuàng)面參與皮膚的再上皮化過(guò)程。表皮干細(xì)胞(ESCs)在皮膚發(fā)生急性創(chuàng)傷后在多種因素的作用下向創(chuàng)緣聚集并參與創(chuàng)面的再上皮化修復(fù)。但在糖尿病足創(chuàng)面,上述修復(fù)機(jī)制卻沒(méi)有發(fā)揮作用,我們推測(cè)可能是糖尿病內(nèi)環(huán)境下,表皮干細(xì)胞向創(chuàng)面遷移的能力被抑制,從而延遲了創(chuàng)面的愈合。容積激活型(或敏感型)氯通道(VACC)是細(xì)胞在滲透性刺激的情況下能激活出容積激活型氯電流((ICl,vol)的一類陰離子通道。在低滲性刺激、細(xì)胞發(fā)生腫脹后,Cl-和K+分別通過(guò)VACC和K+離子通道(如BK通道)外流,伴隨著滲透性水分子外流,導(dǎo)致細(xì)胞的容積減小。上述過(guò)程稱之為調(diào)節(jié)性容積減少(RVD)。VACC及RVD被證實(shí)參與了細(xì)胞的增殖及遷移功能,而后兩者對(duì)于創(chuàng)面的再上皮化進(jìn)程是非常重要的。研究證實(shí)Cl C-2氯通道參與了細(xì)胞內(nèi)Cl-離子濃度的調(diào)節(jié)進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞容積改變及細(xì)胞的遷移。然而,Cl C-2氯通道是否參與了表皮干細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)并在糖尿病難愈性創(chuàng)面的形成過(guò)程中發(fā)揮作用尚不清楚。目的:分析糖尿病高糖狀態(tài)、Cl C-2通道及細(xì)胞遷移之間的相關(guān)性,探討Cl C-2通道在糖尿病表皮干細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)中的作用及相關(guān)的調(diào)控機(jī)制,充實(shí)糖尿病創(chuàng)面延遲愈合的基礎(chǔ)理論,為指導(dǎo)臨床實(shí)踐打下基礎(chǔ)。方法:糖尿病的高糖狀態(tài)是引起ESCs細(xì)胞功能改變的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境,本研究用高糖培養(yǎng)的方法培養(yǎng)用Ⅳ型膠原分離的大鼠表皮干細(xì)胞,檢測(cè)并觀察糖尿病狀態(tài)下Cl C-2通道的表達(dá)、容積敏感型氯電流及細(xì)胞遷移能力的改變情況;用慢病毒載體將Cl C-2 m RNA對(duì)應(yīng)的sh RNA導(dǎo)入正常表皮干細(xì)胞以模擬糖尿病狀態(tài)下Cl C-2通道表達(dá)受抑制的情況,觀察相應(yīng)的細(xì)胞功能如遷移能力和ICl,vol改變的情況;最后從PI3K信號(hào)入手,探討糖尿病影響Cl C-2表達(dá)和相關(guān)功能改變的機(jī)制。結(jié)果:1.細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)Ⅳ型膠原快速黏附法分離培養(yǎng)得到的細(xì)胞。細(xì)胞上β1-整合素及K19蛋白表達(dá)均為陽(yáng)性,說(shuō)明該法培養(yǎng)所得細(xì)胞為表皮干細(xì)胞;2.免疫細(xì)胞熒光、Real time-PCR和免疫蛋白印跡檢測(cè)的ESCs的細(xì)胞Cl C-2通道表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)Cl C-2在細(xì)胞膜上表達(dá),糖尿病狀態(tài)下Cl C-2通道的表達(dá)下降;全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)ESCs的容積敏感型氯電流,高糖培養(yǎng)的ESCs容積敏感型氯電流受到抑制;此外,細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高糖培養(yǎng)的ESCs的體外遷移能力下降;3.酶切證實(shí)攜帶sh RNA的慢病毒載體構(gòu)建成功,可有效感染ESCs,估計(jì)感染效率達(dá)到90%以上,鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化;Real time-PCR和免疫蛋白印跡檢測(cè)各組Cl C-2通道表達(dá)抑制效率后以抑制效率最高的進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn);4.慢病毒轉(zhuǎn)染的ESCs的容積敏感型氯電流及細(xì)胞體外遷移能力受到抑制;5.Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)高糖培養(yǎng)的ESCs中PI3K的磷酸化水平下降;6.PI3K抑制劑渥曼青霉素可以抑制Cl C-2通道的表達(dá)、細(xì)胞的ICl,vol及遷移運(yùn)動(dòng)。結(jié)論:1.糖尿病大鼠表皮干細(xì)胞Cl C-2通道的表達(dá)下降,同時(shí)細(xì)胞的容積敏感型氯電流及遷移能力受到抑制,這三者之間可能存在相關(guān)性;2.慢病毒介導(dǎo)的Cl C-2 m RNA對(duì)應(yīng)的sh RNA可以有效抑制Cl C-2通道的表達(dá),成功模擬了糖尿病狀態(tài)下Cl C-2表達(dá)下降、容積敏感型氯電流及細(xì)胞體外遷移能力受抑制的情況,說(shuō)明ESCs的Cl C-2通道與細(xì)胞ICl,vol及遷移能力有關(guān);3.糖尿病狀態(tài)通過(guò)抑制PI3K的磷酸化而抑制Cl C-2的表達(dá),進(jìn)而抑制了ESC的容積敏感型氯電流及體外遷移能力。
【關(guān)鍵詞】：糖尿病難愈性創(chuàng)面 高糖培養(yǎng) 表皮干細(xì)胞 Cl C-2 容積敏感型氯電流 細(xì)胞遷移
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R587.2
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-7
• 英文摘要7-10
• 中文摘要10-12
• 第一章 前言12-14
• 第二章 糖尿病大鼠表皮干細(xì)胞Cl C-2 通道表達(dá)及功能受抑制14-43
• 2.1 大鼠表皮干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定14-19
• 2.2 糖尿病大鼠表皮干細(xì)胞Cl C-2 通道的表達(dá)改變19-30
• 2.3 糖尿病大鼠表皮干細(xì)胞遷移能力的改變30-35
• 2.4 糖尿病大鼠表皮干細(xì)胞的容積敏感型氯電流的改變35-41
• 2.5 討論41-43
• 第三章 Cl C-2 shRNA慢病毒的構(gòu)建、鑒定以及轉(zhuǎn)染后對(duì)ESC功能的影響43-59
• 3.1 ClC-2 shRNA慢病毒的構(gòu)建、鑒定及對(duì)表皮干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染43-53
• 3.2 pGreenPuro-CLCN2 RNAi慢病毒對(duì)表皮干細(xì)胞遷移功能的影響53-55
• 3.3 p Green Puro-CLCN2 RNAi慢病毒對(duì)表皮干細(xì)胞容積敏感型氯電流的影響55-57
• 3.4 討論57-59
• 第四章 糖尿病狀態(tài)通過(guò)抑制PI3K通路抑制ClC-2 的表達(dá)及功能59-69
• 4.1 糖尿病狀態(tài)抑制表皮干細(xì)胞PI3K的磷酸化作用59-61
• 4.2 渥曼青霉素對(duì)表皮干細(xì)胞Cl C-2 表達(dá)的影響61-63
• 4.3 渥曼青霉素對(duì)表皮干細(xì)胞遷移能力的影響63-65
• 4.4 渥曼青霉素對(duì)表皮干細(xì)胞容積敏感型氯電流的影響65-66
• 4.5 討論66-69
• 全文總結(jié)69-70
• 參考文獻(xiàn)70-79
• 文獻(xiàn)綜述一 糖尿病創(chuàng)面研究進(jìn)展79-92
• 參考文獻(xiàn)84-92
• 文獻(xiàn)綜述二 干細(xì)胞與皮膚創(chuàng)面修復(fù)92-105
• 參考文獻(xiàn)98-105
• 文獻(xiàn)綜述三 離子通道與細(xì)胞遷移105-118
• 參考文獻(xiàn)112-118
• 攻讀博士學(xué)位期間的研究成果118-119
• 致謝119

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 蘇靜;周磊;張宏宇;孫連坤;康勁松;;氯通道ClC-2反義寡核苷酸對(duì)順鉑作用下神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞侵襲力的影響[J];吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2009年01期

2 郭銳;曹川;王珍祥;李U，

本文編號(hào)：969128