發(fā)布時(shí)間：2017-10-03 17:33

  本文關(guān)鍵詞：胃癌中HMGA2通過SOX7調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤細(xì)胞干性獲取的機(jī)制研究

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【摘要】：背景和目的：胃癌是消化道腫瘤中最常見的惡性腫瘤之一。近年來,隨著腫瘤綜合治療的開展,胃癌死亡率雖有所下降,但治療效果并無突破性進(jìn)展,在國內(nèi)其發(fā)病率和死亡率仍然位于各種惡性腫瘤的前列。目前認(rèn)為,導(dǎo)致胃癌治療失敗、預(yù)后不佳乃至患者死亡的主要原因是腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移,而癌細(xì)胞的侵襲和遷移是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。大量研究表明,上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)與惡性腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān),也是近年來探討腫瘤轉(zhuǎn)移的研究熱點(diǎn)。EMT是多細(xì)胞生物胚胎發(fā)生發(fā)育過程中的一種常見現(xiàn)象。在EMT過程中,上皮細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化,演變?yōu)轭愃瞥衫w維細(xì)胞的間質(zhì)細(xì)胞表型,主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞極性消失,連接上皮細(xì)胞間緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)降低,細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)增多,細(xì)胞侵襲和抗凋亡能力增強(qiáng)；同時(shí)還可使腫瘤細(xì)胞獲得干細(xì)胞的特性,誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞(tumor stem cells, TSCs)的發(fā)生,進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。高遷移率族蛋白A2 (High mobility group protein A2, HMGA2)是一種非組蛋白染色體蛋白,作為一種結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子,其本身缺乏轉(zhuǎn)錄活性,但是可以通過改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)來調(diào)節(jié)其他基因的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而影響胚胎形成、組織發(fā)育和腫瘤發(fā)生。HMGA2在分化成熟組織中低表達(dá)或不表達(dá),而在胚胎發(fā)育和惡性腫瘤組織中表達(dá)明顯上調(diào)。此外,HMGA2能通過干擾細(xì)胞周期而促使上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化及腫瘤細(xì)胞獲得干細(xì)胞特性,進(jìn)而維持腫瘤細(xì)胞的分化和自我更新能力。SOX7是含HMG domain的SOX轉(zhuǎn)錄因子家族SOX F亞族的一個(gè)成員。研究發(fā)現(xiàn),SOX7基因的C端存在轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域,作用機(jī)制主要由于該基因是Wnt/β-catenin信號通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子,通過抑制Wnt/p-catenin信號通路,使細(xì)胞的異常增生活動終止,從而發(fā)揮其腫瘤抑制的功能。本課題前期研究使用染色質(zhì)共沉淀加啟動子芯片方法(ChβP-on-chip),并通過KEGG-PATHWAY分析芯片結(jié)果,預(yù)測SOX7可能是HMGA2通過Wnt/p-catenin信號通路影響胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT的下游靶基因。本研究旨在從胃癌組織水平、體外細(xì)胞學(xué)檢測及裸鼠移植瘤體內(nèi)驗(yàn)證等方面,探討轉(zhuǎn)錄因子HMGA2通過SOX7調(diào)控胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT和腫瘤細(xì)胞干性獲取的機(jī)制。方法：(1)采用免疫組化SP法檢測158例胃癌組織中HMGA2與Oct4的表達(dá),分析兩者在胃癌組織中表達(dá)水平的相關(guān)性、兩者表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系,以及對預(yù)后的影響；(2)挑選合適的胃癌細(xì)胞株(MKN-28,SGC-7901和MKN-45),構(gòu)建過表達(dá)HMGA2的慢病毒載體,轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞MKN-28和SGC-7901細(xì)胞,建立穩(wěn)定過表達(dá)]HVIGA2的胃癌細(xì)胞株,并通過western-blot驗(yàn)證干預(yù)效果；(3)用免疫熒光和western-blot檢測過表達(dá)HMGA2前后胃癌細(xì)胞中干細(xì)胞標(biāo)志物CD44和Oct4的表達(dá),并通過Trans well、BrdU和Wound Healing等方法進(jìn)行過表達(dá)HMGA2前后胃癌細(xì)胞侵襲、增殖、遷移等功能學(xué)的檢測；(4)通過免疫組化及western-blot分別檢測胃癌組織中HMGA2和SOX7的表達(dá),并分析二者表達(dá)的相關(guān)性；再從細(xì)胞水平檢測過表達(dá)]HMGA2前后胃癌細(xì)胞中HMGA2和SOX7的表達(dá)情況；(5)用生物信息學(xué)方法(UCSC軟件)分析并預(yù)測SOX7基因的啟動子區(qū),然后構(gòu)建SOX7啟動子與HMGA2作用的熒光素酶(Luciferase)報(bào)告基因,進(jìn)一步驗(yàn)證二者是否存在作用關(guān)系；(6)針對SOX7基因啟動子序列,設(shè)計(jì)合成SOX7-siRNA,用后者瞬時(shí)轉(zhuǎn)染內(nèi)源性高表達(dá)SOX7的MKN28細(xì)胞株,并采用qPCR和western-blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果；(7)通過western-blot檢測干擾SOX7前后EMT標(biāo)志物E-cadherin, N-cadherin和Vimentin以及干細(xì)胞標(biāo)志物CD44和Oct4的表達(dá)情況,并進(jìn)行相應(yīng)的細(xì)胞功能學(xué)檢測；(8)通過裸鼠移植瘤模型觀察胃癌細(xì)胞在干預(yù)SOX7前后的成瘤能力、生長情況和裸鼠生存時(shí)間,并通過免疫組化判斷胃癌細(xì)胞在干擾SOX7后是否在體內(nèi)也能促進(jìn)EMT和腫瘤細(xì)胞干性獲取,從而進(jìn)一步說明SOX7是否是EMT和腫瘤細(xì)胞干性獲取的調(diào)控基因。結(jié)果：(1)胃癌組織中HMGA2與Oct4的表達(dá)成正相關(guān),且二者表達(dá)與胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管入侵、肝轉(zhuǎn)移及臨床TNM分期有關(guān)。(2)過表達(dá)HMGA2的慢病毒載體轉(zhuǎn)染內(nèi)源性低表達(dá)]HMGA2的胃癌細(xì)胞株MKN28和SGC-7901后可使其遷移、侵襲能力明顯增強(qiáng),但增殖能力降低；干細(xì)胞標(biāo)志物CD44和Oct4表達(dá)明顯升高。(3)胃癌組織中HMGA2與SOX7的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；SOX7啟動子熒光素酶(Luciferase)報(bào)告基因發(fā)現(xiàn)HMGA2與其下游的SOX7存在作用關(guān)系,HMGA2過表達(dá)后可以明顯降低SOX7啟動子活性。(4) SOX7-siRNA干擾內(nèi)源性高表達(dá)SOX7的MKN28細(xì)胞后,E-cadherin表達(dá)降低,N-cadherin、Vimentin、CD44及Oct4表達(dá)升高；同時(shí)細(xì)胞侵襲遷移能力增強(qiáng),增值能力抑制；裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),使用SOX7-SiRNA干擾的MKN28細(xì)胞成瘤能力更強(qiáng),但是移植瘤的生長速度減慢。結(jié)論：HMGA2和Oct4在胃癌組織中高表達(dá),且與腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移及患者的預(yù)后有關(guān)；穩(wěn)定過表達(dá)HMGA2及用SOX7-siRNA干擾胃癌細(xì)胞都可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT和腫瘤細(xì)胞干性獲取,可以增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的侵襲遷移和成瘤能力；胃癌中HMGA2和SOX7表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；HMGA2與其下游的SOX7存在結(jié)合靶點(diǎn),胃癌中]HMGA2可以通過抑制SOX7基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控EMT及腫瘤細(xì)胞干性獲取。
【關(guān)鍵詞】：HMGA2 SOX7 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 腫瘤細(xì)胞干性獲取 胃癌
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.2
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照6-10
• 中文摘要10-14
• 英文摘要14-20
• 前言20-24
• 參考文獻(xiàn)22-24
• 第一部分 HMGA2與OCT4在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義24-47
• 1 材料與方法24-35
• 2 結(jié)果35-41
• 3 討論41-44
• 參考文獻(xiàn)44-47
• 第二部分 HMGA2對胃癌細(xì)胞生物學(xué)特性及干性獲取的影響47-69
• 1 材料與方法48-54
• 2 結(jié)果54-61
• 3 討論61-65
• 參考文獻(xiàn)65-69
• 第三部分 SOX7啟動子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建及HMGA2對其調(diào)控的驗(yàn)證69-93
• 1 材料與方法70-78
• 2 結(jié)果78-87
• 3 討論87-90
• 參考文獻(xiàn)90-93
• 第四部分 SOX7在HMGA2調(diào)控胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及干性獲取中的作用93-114
• 1 材料與方法93-102
• 2 結(jié)果102-108
• 3 討論108-111
• 參考文獻(xiàn)111-114
• 全文總結(jié)114-116
• 文獻(xiàn)綜述116-133
• 參考文獻(xiàn)126-133
• 致謝133-134
• 攻讀學(xué)位期間的主要研究成果134

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 宋隆明;;SOX7對胃癌MKN45細(xì)胞株體外遷移侵襲的影響[J];重慶醫(yī)學(xué);2012年24期

2 許禮偉;葉燕霞;葉顯明;江福能;秦國強(qiáng);鐘惟德;;SOX7與SOX9在鑒別前列腺癌與前列腺增生中的作用[J];現(xiàn)代泌尿生殖腫瘤雜志;2014年03期

3 ;[J];;年期

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1 孔德全;胃癌中HMGA2通過SOX7調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤細(xì)胞干性獲取的機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2015年

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本文編號：965805