本文關鍵詞：逍遙散調控海馬β-arrestin2介導的信號通路改善肝郁證的機制研究

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【摘要】：背景：肝郁證即肝氣郁結證,是指肝氣疏泄不及而產生的以氣機郁滯為特點的證候,它屬于中醫(yī)“郁證”的一種證型。《內經》中首次提出“郁”的概念,后世醫(yī)家又提出了五郁、六郁學說。肝郁,則是由五郁、六郁、情志致郁等逐漸演化過來的,將五氣之郁與臟腑之郁聯(lián)系起來。近年臨床流行病學資料顯示,在五臟病證中,中醫(yī)肝臟病證占總體病證的40%,而肝郁證作為肝臟病證的基本病理變化,可見于臨床各種疾病的初起階段。因此肝郁證一直是近年來中醫(yī)領域研究的熱點。肝郁證的研究分臨床研究和動物實驗研究,在其本質研究方面,因許多臨床樣本的不可獲取性,動物研究更具優(yōu)勢。中醫(yī)證候動物模型的建立是中醫(yī)現(xiàn)代化研究的重要方法。在多種模型復制方法中,慢性不可預知溫和刺激法(chronic unexpected mild stress, CUMS)在國內外的認可度最高,它可以誘導動物的肝郁證表現(xiàn),其應激因子的多樣性、溫和性和不可預知性很好地模擬了人類肝郁證的病因,且不會造成動物的軀體損害。肝郁證的方證研究也是其本質研究的重要方面。“方從法出,法隨證立”,辨證論治是中醫(yī)的核心。中醫(yī)證候研究具有以證選方、以方測證、方證互參的特點,通過這一特點,我們可以通過觀察某一證型在相應方藥治療前后臨床癥狀的改善來反證辨證的準確性。近年來對肝郁證本質的研究頗多,已初步證實肝郁證具有現(xiàn)代病理生理學基礎,認為肝郁證是在抑郁、焦慮等不良心理應激狀態(tài)下,出現(xiàn)高級神經中樞調節(jié)功能的紊亂,進而影響到神經、免疫、消化、運動、感覺等多系統(tǒng)而出現(xiàn)的病理改變和病證表現(xiàn)。近年來對應激相關的下丘腦-垂體-腎上腺素皮質系統(tǒng)和海馬突觸可塑性變化的研究較多,說明海馬在肝郁證的發(fā)病中起著重要作用。中醫(yī)證候是疾病發(fā)生和演變的過程中,某一階段中患者機體當時所處的特定內外環(huán)境的本質反映。證候研究是中醫(yī)理論研究的一個關鍵問題,證候作為一種規(guī)律的病理表現(xiàn),必然存在其相應的物質基礎,但中醫(yī)證候錯綜復雜,如何運用現(xiàn)代科學的方法來揭示其本質是其研究的關鍵點。近年來,一門新興的學科-蛋白質組學的出現(xiàn)為解決這一問題提供了一種新方法。蛋白質組學是研究細胞內全部蛋白質表達方式和功能方式的一門學科,它從整體水平上來認識生命現(xiàn)象,與中醫(yī)學的“整體觀念”類似。細胞內的蛋白質不是一成不變的,蛋白質組作為所有蛋白質的整合,也是不斷變化的。而中醫(yī)證候在疾病不同階段的病機和表現(xiàn)也是不同的,存在一定的演變規(guī)律,這些變化的物質基礎可能就反應在蛋白質組的水平。將蛋白質組學應用于中醫(yī)證候的研究中,不僅可以反應不同癥狀的物質基礎,又可以了解不同蛋白質組分在證的演變過程中發(fā)生的變異,通過對證候演變前后的蛋白質組學研究對比來探究中醫(yī)證候的物質基礎變化機制,揭示中醫(yī)證候的內涵,可以為中醫(yī)的客觀化道路打下基礎。因此,本研究擬以海馬組織作為切入點,提取其磷酸化蛋白質,通過蛋白質組學方法進行差異蛋白質的鑒定分析。并根據(jù)該蛋白分析結果的提示,引出肝郁證的關鍵信號分子及其介導的信號通路,進行更深入的研究。同時選用中醫(yī)經典抗肝郁方逍遙散進行干預,并以臨床經典抗抑郁藥氟西汀(研究表明其可有效改善悶悶不樂,興趣減退等肝郁證癥狀)作為陽性對照藥,以期對海馬在肝郁證發(fā)病機制中的作用提供更進一步的證據(jù),為繼續(xù)深入研究肝郁證的本質奠定基礎。目的：采用CUMS聯(lián)合孤養(yǎng)的方法復制肝郁證大鼠模型,通過觀察模型大鼠的一般狀態(tài)、糖水消耗率及行為學指標等評價模型的成功與否。然后用蛋白質組學的方法,對肝郁證模型大鼠海馬磷酸化蛋白質進行差異表達分析,并根據(jù)分析結果的提示引出肝郁證的關鍵信號分子及其介導的信號通路并進一步研究。試圖借助肝郁證大鼠模型,利用蛋白質組學的方法找到肝郁證相關的特異性蛋白質,為中醫(yī)證候理論的研究找到相應的物質基礎,也可為肝郁證的臨床治療提供新思路,有望發(fā)現(xiàn)其治療的新靶點。并通過逍遙散和氟西汀對模型大鼠進行干預,發(fā)現(xiàn)其蛋白表達水平的差異,探討逍遙散改善肝郁證的作用機理,并利用中醫(yī)證候“以方測證,方證互參”的特點,為肝郁證的本質研究及治療提供新思路和新方法。方法：本研究在中醫(yī)證候理論指導下通過CUMS聯(lián)合孤養(yǎng)的方法復制肝郁證大鼠模型,采用中藥復方逍遙散進行干預,并應用蛋白質組學的方法,以海馬組織為研究對象,找出模型組大鼠與對照組及逍遙散組大鼠海馬組織的差異表達蛋白點,通過鑒定分析并引出肝郁證的關鍵信號分子及其介導的信號通路,采用免疫組化(Immunohistochemical, IHC)、免疫印跡(Western blot, WB)及熒光定量PCR (real-time polymerase chain reaction, RT-PCR)技術進一步研究。1、CUMS聯(lián)合孤養(yǎng)的方法復制肝郁證大鼠模型動物分組及模型復制：清潔級雄性SD大鼠40只,體重200±20g,適應性飼養(yǎng)一周后隨機分為對照組、模型組、模型加逍遙散組(簡稱逍遙散組)、模型加氟西汀組(簡稱氟西汀組),每組10只。對照組5只一籠,其余三組單籠飼養(yǎng),并接受CUMS程序干預,一周內刺激方式隨機使用,連續(xù)三周。藥物干預：逍遙散組給予19 g/kg/d的逍遙散溶液,氟西汀組給予2 mg/kg/d的氟西汀混懸液,對照組和模型組均給予蒸餾水,按照10ml/kg灌胃,藥物總量按一日兩次分服。模型評價：通過對大鼠一般狀態(tài)的觀察、糖水消耗率及行為學檢測等判斷模型的可靠性。2、運用HE染色和尼氏染色,觀察大鼠海馬組織的形態(tài)學變化。3、海馬磷酸化蛋白質的2-DE分離及凝膠圖像優(yōu)化海馬磷酸化蛋白質的2-DE分離,對同類混合樣本以組間配對的形式,同時進行2-DE分離,并重復3次。2-DE分離獲得的凝膠,經處理后掃描成圖像。用PDQuest7.0軟件分析凝膠圖像,獲取每個蛋白質的表達量、等電點和分子量等信息。并將組間表達量相差2倍以上的蛋白質斑點設定為差異表達蛋白質,由軟件自動生成分析結果,再結合人工驗證。4、差異表達蛋白質斑點的質譜鑒定和數(shù)據(jù)庫確認用結合基質輔助激光解吸電飛行時間質譜技術(matrix assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry, MALDI-OF-MS)對差異蛋白質斑點進行肽質量指紋(peptide mass fingerprint, PMF)檢測。根據(jù)http://www.uniprot.org/上的蛋白質數(shù)據(jù)庫檢索最終確定結果蛋白質。5、用WB、IHC和酶聯(lián)免疫吸附檢測(enzyme-linked immunoabsorbent assay, ELISA)等方法檢測海馬中β-arrestin2和CRHR蛋白表達及相關激素的變化情況。6、用WB和RT-PCR法檢測海馬中β-arrestin 2 介導的 PP2A-Akt-mTOR信號通路的表達情況。7、用WB和IHC法檢測海馬中β-arrestin2介導的ERK-BDNF信號通路的表達情況。8、統(tǒng)計學方法實驗結果均采用平均值±標準差(X±S)的形式表示,SPSS 13.0軟件統(tǒng)計包用于數(shù)據(jù)處理。大鼠每周的體重情況采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析,其余的指標,多樣本的均數(shù)比較均采用單因素方差分析,若方差齊,多重比較采用LSD法檢驗,若方差不齊,則采用Welch分析,多重比較采用Games-Howell法檢驗。同組動物造模前后的均數(shù)比較采用配對樣本的t檢驗。所有的檢驗方法均以P0.05作為具有顯著性差異。結果：1、采用CUMS聯(lián)合孤養(yǎng)的方法成功復制了肝郁證大鼠模型。造模3周后,從一般狀態(tài)來看,造模初期,模型組大鼠表現(xiàn)為焦慮、煩躁、掙扎,隨后逐漸麻木,出現(xiàn)行動遲緩、躲在角落、食欲減退、皮毛無光澤、便溏等肝郁證表現(xiàn)。逍遙散組和氟西汀組上述表現(xiàn)較輕,且各種癥狀的發(fā)展變化相對緩慢。對照組則一直活潑好動,未見異常行為狀態(tài)。各組間體重增長具有顯著性差異,模型組體重最低,逍遙散組和氟西汀組體重則高于模型組,而對照組大鼠體重則一直處于穩(wěn)步增長中,體重最高。曠場實驗發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的直立數(shù)和爬格數(shù)均顯著低于對照組,逍遙散組對其直立數(shù)和爬格數(shù)均有提高,氟西汀組則僅對爬格數(shù)有所提高。糖水消耗實驗提示各組大鼠糖水消耗率具有顯著性差異,模型組的糖水消耗率低于其他組。食物消耗實驗提示,模型組和兩藥物組食物消耗量均顯著低于對照組,但逍遙散組食物消耗量高于模型組,而氟西汀組則與模型組無顯著性差異。2、HE染色發(fā)現(xiàn)模型組神經元縮小,細胞形態(tài)改變?yōu)椴灰?guī)則形,逍遙散組和氟西汀組神經元改變則較模型組改善,尼氏染色發(fā)現(xiàn)模型組尼氏體數(shù)量減少,而逍遙散組和氟西汀組的尼氏體數(shù)量則較模型組增加。3、獲得了高質量的海馬組織磷酸化蛋白質的2-DE圖像,發(fā)現(xiàn)了10個肝郁證大鼠的差異蛋白,其中2個在模型組表達下調,8個表達上調,并鑒定出了蛋白的相關信息。4、β-arrestin 2和CRHR蛋白表達及相關激素的檢測結果發(fā)現(xiàn)：模型大鼠海馬的P-arrestin2蛋白表達較對照組下降,CRHR2蛋白表達則上調,而逍遙散和氟西汀使其表達水平得到恢復。CRHR1蛋白表達則無顯著性差異。血清激素檢測,ACTH和CRH的濃度在各組大鼠間無顯著性差異,而模型組大鼠的CORT和Urocortin-2的濃度高于對照組,具有顯著性差異,而逍遙散組和氟西汀組CORT和Urocortin-2濃度則較模型組降低。腦脊液激素檢測,CRH濃度在各組大鼠間無顯著性差異,模型組Urocortin-2濃度高于對照組,具有顯著性差異。5、β-arrestin2介導的PP2A-Akt-mTOR信號通路研究發(fā)現(xiàn)：各組大鼠PP2A c、mTPR、Akt蛋白的表達無顯著性差異,而PP2A b、p-mTOR和p-Akt蛋白的表達則具有顯著性差異。其中PP2A b蛋白在模型組表達水平較對照組升高,而逍遙散組和氟西汀組的表達水平較模型組降低,p-mTOR和p-Akt蛋白在模型組表達水平較對照組降低,而逍遙散組和氟西汀組的表達水平較模型組升高。PP2Ac mRNA表達在各組間無統(tǒng)計學意義,PP2A b mRNA的表達結果同PP2Ab蛋白表達情況。6、β-arrestin2介導的ERK-BDNF信號通路研究發(fā)現(xiàn)：各組大鼠ERK蛋白的表達無統(tǒng)計學意義,而p-ERK、BDNF 和 TrkB蛋白的表達則具有顯著性差異。這三個蛋白在模型組表達水平均較對照組降低,而逍遙散組和氟西汀組的表達水平較模型組升高。結論：通過對CUMS聯(lián)合孤養(yǎng)復制的肝郁證大鼠模型海馬組織磷酸化蛋白質的蛋白質組學研究,發(fā)現(xiàn)了10個肝郁證大鼠的差異蛋白并鑒定出了蛋白的相關信息。并根據(jù)差異蛋白分析結果引出了肝郁證的關鍵信號分子β-arrestin 2,并研究了CRHR表達與相關激素的變化情況,以及其介導的PP2A-Akt-mTOR和ERK-BDNF信號通路。結果提示β-arrestin 2通過對CRHR2表達及Urocortin-2、 CORT濃度的影響,及介導PP2A-Akt-mTOR、ERK-BDNF信號通路改變引起大鼠海馬突觸可塑性的改變,導致肝郁證。而逍遙散可以通過調控海馬β-arrestin2介導的信號通路來改善肝郁證。本研究以前期蛋白質組學結果作為切入點,提出β-arrestin 2是介導PP2A-Akt-mTOR, ERK-BDNF信號通路、調控肝郁海馬可塑性的關鍵分子,是肝郁證形成的新靶標,具有原始創(chuàng)新。
【關鍵詞】：肝郁證 PP2A β-arrestin 2 Akt mTOR BDNF
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R285
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 第一章 理論研究19-37
• 第一節(jié) 肝郁證及其研究現(xiàn)狀19-30
• 1、肝郁證的源流19-21
• 2、肝郁證的病因病機21-22
• 3、肝郁證的動物模型研究22-24
• 4、肝郁證的研究進展24-29
• 5、肝郁證的治療29-30
• 第二節(jié) 蛋白質組學和中醫(yī)證候研究30-33
• 1、蛋白質組與蛋白質組學30-31
• 2、蛋白質組學應用于中醫(yī)證候研究的展望31-33
• 第三節(jié) 海馬及β-arrestin 2介導的信號通路與肝郁證的相關性探討33-37
• 1、肝郁證中存在海馬突觸可塑性障礙33-34
• 2、β-arrestin 2是介導海馬突觸可塑性的關鍵信號分子34-37
• 第二章 實驗研究37-83
• 第一節(jié) 肝郁證動物模型的復制37-50
• 1、材料37-38
• 2、方法38-41
• 3、結果41-46
• 4、討論46-50
• 第二節(jié) 肝郁證大鼠海馬組織差異蛋白點分析50-60
• 1、海馬組織的形態(tài)學觀察50-53
• 2、海馬組織蛋白質組2-DE分離圖像的制備和分析53-57
• 3、海馬組織差異蛋白質的質譜鑒定和數(shù)據(jù)庫確認57-58
• 4、討論58-60
• 第三節(jié) β-arrestin 2介導的信號通路在肝郁證中的調控機制研究60-83
• 1、β-arrestin 2與CRH受體及血清和腦脊液中相關激素變化的相關性60-70
• 2、β-arrestin 2介導的PP2A-Akt-mTOR信號通路研究70-77
• 3、β-arrestin 2介導的ERK-BDNF信號通路研究77-80
• 4、討論80-83
• 全文小結83-85
• 參考文獻85-100
• 縮略詞對照表100-101
• 論文發(fā)表情況101-102
• 致謝102-104
• 統(tǒng)計學證明104

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本文編號：956661