本文關(guān)鍵詞：孕期母體鎘暴露與胎兒生長受限的關(guān)聯(lián)及其機(jī)制研究

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【摘要】：孕期母體鎘暴露與胎兒生長受限(fetal growth restriction,FGR)的關(guān)聯(lián)尚存在爭議。本課題擬用實驗室前期建立的中國安徽出生隊列研究(China-Anhui Birth Cohort Study,C-ABCS)平臺,以合肥出生隊列3352對單胎母嬰為樣本人群,分析孕期不同階段鎘暴露分別與低出生體重(low birth weight,LBW)和小于胎齡兒(small for gestational age,SGA)的關(guān)聯(lián)強度;在成功建立鎘誘導(dǎo)胎鼠生長受限的孕鼠模型基礎(chǔ)上,觀察鎘在母體、胎盤和胎體內(nèi)的分布和代謝情況以及對胎盤結(jié)構(gòu)與功能的損害效應(yīng);探討孕期鎘暴露對小鼠胎盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控作用,并進(jìn)一步研究鎘對人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控作用;研究自由基清除劑N-叔丁基-α-苯基硝酮(N-tert-butyl-α-phenylnitrone,PBN)對鎘誘導(dǎo)胎盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的拮抗效應(yīng),以闡明活性氧在鎘誘導(dǎo)胎盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用;探討IRE1小干擾RNA(small interfering RNAs,si RNAs)轉(zhuǎn)染對鎘下調(diào)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運泵表達(dá)的拮抗效應(yīng),以闡明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)信號通路在鎘損害人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞功能中的作用。本研究為最終闡明孕期母體鎘暴露引起胎兒生長受限的分子機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。第一部分:孕期鎘暴露與胎兒生長受限(FGR)關(guān)聯(lián)的人群研究目的:探討孕期不同階段鎘暴露分別與低出生體重(LBW)和小于胎齡兒(SGA)的關(guān)聯(lián)強度。方法:本研究從C-ABCS中選擇合肥出生隊列,抽取該隊列已經(jīng)收集的3352例孕婦和新生兒出生資料、孕婦血清標(biāo)本,用石墨爐原子吸收分光光度法檢測孕婦血清鎘含量。結(jié)果:鎘檢測結(jié)果顯示,該隊列孕婦平均血清鎘含量為0.89mg/L。按照孕婦血清鎘含量≥P75分為高鎘組,而血清鎘含量P75低鎘組,分析孕期不同階段母體高鎘暴露引起LBW和SGA發(fā)生的RR及其95%CI。整個孕期3352例孕婦資料分析結(jié)果表明,孕期高鎘暴露組新生兒LBW發(fā)生率為4.3%(RR為2.25;95%CI:1.45,3.49;P0.001),在控制孕期BMI、孕婦年齡、月平均收入和孕婦血清采集時間等變量后,高鎘暴露誘導(dǎo)新生兒發(fā)生LBW的RR為2.21(95%CI:1.43,3.42;P0.001);孕期高鎘暴露組SGA發(fā)生率為10.5%(RR為1.43;95%CI:1.09,1.86;P=0.009),調(diào)整RR為1.41(95%CI:1.08,1.85;P=0.011)。孕早期1122例孕婦資料分析結(jié)果顯示,孕早期高鎘暴露組新生兒LBW發(fā)生率為2.5%(RR為1.26;95%CI:0.52,3.08;P=0.608),在控制孕期BMI、孕婦年齡和月平均收入等變量后,高鎘暴露誘導(dǎo)新生兒發(fā)生LBW的RR為1.26(95%CI:0.52,3.08;P=0.606);孕早期高鎘暴露組SGA發(fā)生率為9.4%(RR為1.20;95%CI:0.75,1.93;P=0.446),調(diào)整RR為1.18(95%CI:0.73,1.90;P=0.498)。孕中晚期2230例孕婦資料分析結(jié)果顯示,孕中晚期高鎘暴露組新生兒LBW發(fā)生率為5.2%(RR為2.70;95%CI:1.63,4.49;P0.001),在控制孕期BMI、孕婦年齡和月平均收入等變量后,高鎘暴露誘導(dǎo)新生兒發(fā)生LBW的RR為2.79(95%CI:1.68,4.66;P0.001);孕中晚期高鎘暴露組SGA發(fā)生率為11.1%(RR為1.55;95%CI:1.12,2.13;P=0.008),調(diào)整RR為1.54(95%CI:1.11,2.12;P=0.009)。結(jié)論:孕中晚期母體高鎘暴露顯著升高LBW和SGA發(fā)生風(fēng)險。第二部分:孕期鎘暴露損害胎鼠發(fā)育和胎盤結(jié)構(gòu)與功能的動物實驗研究目的:探討孕期鎘暴露對胎鼠發(fā)育和胎盤結(jié)構(gòu)與功能的損害作用。方法:本研究由3個實驗組成。實驗1,本研究采用兩種方法建立胎兒生長受限的孕鼠模型,一種方法是受孕第9天(gestational day 9,GD9)小鼠經(jīng)腹腔單次給予氯化鎘(4.5 mg/kg)溶液,另一種方法是受孕第13天至17天(GD13-17)小鼠每日上午經(jīng)腹腔注射單次給予氯化鎘(0.5 mg/kg)溶液。兩種方法均于GD18早晨剖殺孕鼠,然后測量胎鼠身長和重量。實驗2,為了探討孕期母體鎘暴露對母體、胎盤和胎體鎘分布的近期和遠(yuǎn)期影響,受孕第9天小鼠被腹腔單次給予氯化鎘(4.5mg/kg),GD10和GD18分別剖殺孕鼠,收集母鼠(血清、肝臟和腎臟)、胎盤和胎鼠相關(guān)標(biāo)本,用石墨爐原子吸收分光光度法檢測樣品鎘含量。實驗3,為了探討孕期母體鎘暴露對小鼠胎盤結(jié)構(gòu)與功能的影響,受孕第9天小鼠被單次腹腔注射NS或氯化鎘(4.5 mg/kg),于GD10和GD18分別收集小鼠胎盤。GD18小鼠胎盤被稱重和測量胎盤直徑,GD10和GD18部分胎盤固定后做組織病理學(xué)檢查,部分胎盤提取RNA行定量PCR檢測。結(jié)果:實驗1結(jié)果顯示,孕中期單次鎘暴露或孕晚期多次鎘暴露均明顯降低胎鼠身長和體重,而母鼠無明顯中毒體征。這提示,孕期母體鎘暴露誘導(dǎo)胎鼠生長受限。實驗2結(jié)果發(fā)現(xiàn),GD9小鼠被鎘處理后,GD10母鼠血清、肝臟和腎臟鎘含量分別升高2.8、80.5和13.4倍,GD10胎盤和胚胎分別升高60.2和11.5倍;GD18母鼠血清、肝臟和腎臟鎘含量分別升高2.2、300.9和34.3倍,GD18胎盤和胚胎分別升高47.4和4.9倍,而GD18胎鼠血清鎘含量無變化。這些研究結(jié)果充分提示,進(jìn)入母體的鎘在胎盤組織蓄積,僅有少量鎘透過胎盤屏障進(jìn)入胎鼠體內(nèi)。實驗3結(jié)果表明,孕期鎘暴露明顯減輕小鼠胎盤重量和降低胎盤直徑。HE染色結(jié)果顯示,孕期母體鎘暴露明顯減少胎盤迷路層平均血竇區(qū)面積;TUNEL染色和增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)免疫染色結(jié)果表明,孕期母體鎘暴露明顯促進(jìn)胎盤細(xì)胞凋亡和抑制胎盤細(xì)胞增殖。定量RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn),孕期母體鎘暴露明顯下調(diào)小鼠胎盤營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運泵(Glut1、Znt1、Zip1和Pcft)、生長因子及其受體(Pgf、Igf2、Vegfr1和Igf2r)m RNA表達(dá)。這些結(jié)果提示,孕期母體鎘暴露明顯引起小鼠胎盤結(jié)構(gòu)與功能障礙。結(jié)論:孕期母體鎘暴露引起胎盤鎘蓄積,導(dǎo)致胎盤結(jié)構(gòu)與功能障礙,并誘發(fā)胎鼠生長受限。第三部分:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)IRE1信號在鎘損害胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞功能中的作用及其機(jī)制研究目的:探討活性氧在鎘誘發(fā)胎盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)IRE1信號在鎘損害胎盤功能中的作用。方法:本實驗由3個實驗組成。實驗1,為了探討鎘對小鼠胎盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)的影響,受孕第9天小鼠被單次氯化鎘(4.5 mg/kg),于鎘處理后0、2、8和24 h收集小鼠胎盤,分別檢測不同時點小鼠胎盤組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)相關(guān)基因與蛋白的表達(dá)情況。實驗2,為了探討活性氧在鎘誘導(dǎo)胎盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的調(diào)控作用,受孕第9天小鼠在氯化鎘(4.5 mg/kg,i.p.)處理前0.5 h和處理后4 h給予PBN(100 mg/kg,i.p.),于鎘處理后8和24 h收集小鼠胎盤,檢測胎盤氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)。實驗3,為了探討未折疊蛋白反應(yīng)下游IRE-1a信號通路在鎘下調(diào)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運泵和生長因子表達(dá)中的作用,人JEG-3細(xì)胞在鎘處理前轉(zhuǎn)染IRE-1 si RNAs,于鎘處理后12 h收獲細(xì)胞,用定量RT-PCR技術(shù)檢測營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運泵和生長因子m RNA表達(dá)。結(jié)果:實驗1結(jié)果顯示,孕期母體鎘暴露明顯上調(diào)小鼠胎盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)相關(guān)基因(Grp78和Atf4)m RNA及相關(guān)蛋白(GRP78,pe IF2a和CHOP)表達(dá)。細(xì)胞實驗還發(fā)現(xiàn),不同濃度的鎘顯著上調(diào)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)相關(guān)蛋白(p IRE1a、pe IF2a、CHOP、p JNK和GRP78)表達(dá),但存在時間效應(yīng),鎘暴露2 h后胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞GRP78蛋白表達(dá)明顯上調(diào),而12 h和24 h后GRP78蛋白表達(dá)卻顯著下調(diào);鎘暴露6 h后胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞p IRE1a蛋白表達(dá)明顯上調(diào),而24 h的p IRE1a蛋白水平卻低于0 h;隨著時間增加,胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞pe IF2a、CHOP和p JNK蛋白表達(dá)均逐漸升高。上述結(jié)果提示,鎘顯著誘導(dǎo)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)。實驗2結(jié)果表明,自由基清除劑PBN顯著對抗鎘上調(diào)胎盤組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白(GRP78、pe IF2a和CHOP)表達(dá),緩解鎘對小鼠胎盤還原型谷胱甘肽(GSH)的耗竭,且拮抗鎘上調(diào)胎盤組織3-硝基酪氨酸(3-NT)和血紅素氧化酶1(HO-1)蛋白表達(dá)。這些研究結(jié)果提示,活性氧至少部分介導(dǎo)鎘誘導(dǎo)胎盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。實驗3結(jié)果發(fā)現(xiàn),鎘處理明顯下調(diào)人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運泵(GLUT1、FATP4、PCFT)和生長因子(PGF和IGF2)m RNA表達(dá),IRE-1 si RNA預(yù)處理明顯對抗鎘下調(diào)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞生長因子(PGF和IGF2)m RNA表達(dá),而對鎘下調(diào)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運泵(GLUT1、FATP4、PCFT)m RNA表達(dá)無影響。上述結(jié)果提示,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)下游IRE-1信號部分介導(dǎo)鎘損害胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)分泌功能。結(jié)論:鎘暴露顯著誘導(dǎo)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng),活性氧在鎘誘導(dǎo)胎盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中起關(guān)鍵作用,而未折疊蛋白反應(yīng)下游IRE1通路在鎘損害胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)分泌功能中起重要作用。綜合以上三部分研究結(jié)果,本文得出如下結(jié)論:(1)孕期母體鎘暴露顯著升高胎兒生長受限的發(fā)生風(fēng)險;(2)孕期母體鎘暴露引起胎盤鎘蓄積,導(dǎo)致胎盤結(jié)構(gòu)與功能障礙,并誘發(fā)胎鼠生長受限;(3)鎘顯著誘導(dǎo)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng),活性氧在鎘誘導(dǎo)胎盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中起關(guān)鍵作用,而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)IRE1信號在鎘損害胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)分泌功能中起重要作用。
【關(guān)鍵詞】：鎘 胎兒生長受限 胎盤 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 活性氧
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R714.5
【目錄】：

• 英文縮寫詞表7-9
• 中文摘要9-14
• 英文摘要14-21
• 研究背景21-29
• 第一部分：孕期母體鎘暴露與胎兒生長受限關(guān)聯(lián)的人群研究29-40
• 1.1 前言29
• 1.2 方法29-33
• 1.3 結(jié)果33-39
• 1.3.1 母嬰特征及其對母血鎘水平的影響33-34
• 1.3.2 孕期母體高鎘暴露對LBW和SGA發(fā)生的RR及其 95% CI34-36
• 1.3.3 孕早期母體高鎘暴露對LBW和SGA發(fā)生的RR及其 95% CI36-38
• 1.3.4 孕中晚期母體高鎘暴露對LBW和SGA發(fā)生的RR及其 95% CI38-39
• 1.4 小結(jié)39-40
• 第二部分：孕期鎘暴露損害胎鼠和胎盤發(fā)育的動物實驗40-62
• 2.1 前言40-41
• 2.2 材料與方法41-48
• 2.3 結(jié)果48-61
• 2.3.1 孕期不同階段鎘暴露對胎鼠生長發(fā)育的影響48-51
• 2.3.2 孕期鎘暴露對母體、胎盤和胎鼠體內(nèi)鎘轉(zhuǎn)運的影響51-53
• 2.3.3 孕期鎘暴露對小鼠胎盤結(jié)構(gòu)與功能的損害作用53-61
• 2.4 小結(jié)61-62
• 第三部分：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)IRE1信號在鎘損傷胎盤功能中的作用及其機(jī)制研究62-96
• 3.1 前言62-63
• 3.2 材料與方法63-75
• 3.3 結(jié)果75-96
• 3.3.1 鎘暴露誘導(dǎo)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)75-82
• 3.3.2 活性氧在鎘誘導(dǎo)胎盤細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用82-90
• 3.3.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)IRE-1 信號在鎘下調(diào)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞生長因子表達(dá)中的作用90-96
• 3.4 小結(jié)96
• 討論96-101
• 結(jié)論101-102
• 研究不足與下一步研究計劃102-103
• 參考文獻(xiàn)103-113
• 附錄113-117
• 致謝117-119
• 綜述及參考文獻(xiàn)119-139
• 參考文獻(xiàn)129-139

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本文編號：932862