大黃素通過炎癥信號通路調控癲癇發(fā)生及耐藥機制的初步研究

發(fā)布時間：2017-09-28 02:11

本文關鍵詞：大黃素通過炎癥信號通路調控癲癇發(fā)生及耐藥機制的初步研究

【摘要】：癲癇是一組由大腦神經元反復異常同步化放電所引起的短暫中樞神經系統(tǒng)功能失常為特征的慢性中樞神經系統(tǒng)疾病。全球有約超過4000萬癲癇患者,我國約有600萬癲癇患者。大多數(shù)的癲癇患者經過一段時間的規(guī)范藥物治療后,癇性發(fā)作可以得到控制。但是仍有20%-30%的患者藥物治療并不能夠減輕發(fā)作的頻率和強度,被稱為難治性癲病。闡明難治性癲癇的發(fā)生機制,提高癲癇發(fā)作控制率一直是癲癇研究的熱點。以往的研究中,離子通道異常、神經遞質異常、神經網絡重組、信號轉導、線粒體功能異常、自身抗體等是癲癇機制研究的重點。近年來大量研究已經表明炎癥是癲癇產生和癲癇發(fā)作的關鍵因素之一。細胞因子是介導炎癥反應的最基本物質,大量細胞因子與受體結合后通過開放離子通道、激活下游級聯(lián)反應等方式產生廣泛的生物學效應。癲癇發(fā)生中小膠質細胞及星形細胞的活化,釋放IL-1β、TNFα等促炎細胞因子,隨之這些因子觸發(fā)神經元、膠質細胞、血腦屏障等多處的炎癥信號通路,如NF-κB、COX-2、補體系統(tǒng)、TLR信號通路引起廣泛的生物學效應。炎性反應及炎癥因子參與了神經遞質的失衡、突觸傳遞的異常、神經網絡的重構、血腦屏障的破壞等過程,最終導致神經元興奮性增高、癲癇發(fā)作閾值降低。目前IL-1β、IL-6、TNFα、HMGB1等因子的作用研究較為深入,發(fā)現(xiàn)癲癇發(fā)生中新的細胞因子意味著發(fā)現(xiàn)了新的治療靶點,開啟新的治療途徑。除了癲癇的發(fā)生機制外,難治性癲癇的另一個重要研究方向是癲癇“耐藥性”的形成機制。近年來受到腫瘤多藥耐藥機制的啟示,多藥轉運體在癲癇患者腦內的表達越來越受到關注。P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)是其中發(fā)揮最主要作用的轉運蛋白。大量癲癇動物模型及癲癇患者腦組織的研究表明,P-gp在神經元、內皮細胞、腦實質和血管周圍的星形膠質細胞中表達增高,這種過度表達與難治性癲癇的多藥耐藥性呈正相關。近年來對多藥耐藥轉運蛋白的調控機制的研究提示COX-2可能是調控P-gp合成的關鍵因素。COX-2催化的前列腺素E2生成及其他下游反應是諸多炎癥反應中的關鍵環(huán)節(jié),這提示多藥耐藥的形成、P-gp的表達與炎癥也有密切的關系。我們的前期研究通過腦電分析發(fā)現(xiàn)大黃對癲癇具有抑制作用,其機制可能是大黃素抑制突觸前興奮性氨基酸遞質的釋放直接抑制海馬ca1區(qū)錐體神經元epsp,降低由于谷氨酸和nmda受體介導的興奮毒性增高,大黃素可減輕腦水腫、升高sod、na+-k+atp酶活性,降低mda水平,影響多個病理生理通路。大黃素的抗炎作用以被越來越多的研究證實,大黃素對諸多炎癥因子、信號通路都有較為明確的作用。這就提示我們大黃素可能對癲癇的耐藥有一定作用,其機制可能是通過cox-2等炎癥通路實現(xiàn)。本論文分為兩個部分,具體如下:第一部分大黃素通過炎癥信號通路對癲癇的調控目的:建立海人酸(kainicacid,ka)注射大鼠癲癇模型,并以大黃素進行干預,通過高通量細胞因子蛋白芯片分析正常大鼠、ka致癇大鼠及經大黃素處理的癲癇大鼠海馬組織細胞因子的差異表達,分析ka致癇后細胞因子的改變及大黃素的影響,尋找新的分子治療靶點。方法:大鼠分為正常對照組(c組),模型組(m組),大黃素干預組(t組)。c組為正常大鼠無處理,m、t組大鼠腹腔注射12mg/kg的海人酸,t組大鼠腹腔注射海人酸10分鐘后腹腔注射大黃素(200mg/kg)。根據racine評分標準判定癲癇發(fā)作級別,大鼠進行腦電圖描記。采用he染色及透射電鏡對大鼠海馬病理學改變進行觀察。取大鼠海馬組織進行蛋白提取,應用bca法進行蛋白質定量。采用raybio?大鼠l系列抗體芯片i(90)定量檢測細胞因子表達情況。結果:ka注射后大鼠表現(xiàn)出癲癇發(fā)作癥狀,腦電圖出現(xiàn)叢集性、陣發(fā)性發(fā)作的棘波、尖波等癲癇樣波,大黃素組大鼠表現(xiàn)出現(xiàn)癲癇發(fā)作racine分級較模型組降低。he染色示ka注射后8小時,大鼠海馬ca3、ca4區(qū)神經元開始出現(xiàn)壞死、凋亡、丟失,48小時達到頂峰,此后ca3、ca4區(qū)神經元維持穩(wěn)定,而海馬齒狀回顆粒層神經元未見明顯減少。蛋白芯片結果提示,ka注射后大鼠海馬表現(xiàn)出廣泛的細胞因子改變,包括促炎細胞因子il-2、il-3、il-4、il-5、il-12、il-13、tgf-β1、tgf-β2等在造模后短期內即出現(xiàn)表達上調,24小時逐漸恢復正常,以及抗炎細胞因子b7-1/cd80、cntf、cntfr、basic-fgf、csk出現(xiàn)表達下調。細胞膜糖蛋白正向調節(jié)因子tgf-β1、tgf-β2、rage在ka注射后表達增加,糖蛋白負向調節(jié)因子fractalkine表達降低。大黃素能抑制ka腹腔注射導致的促炎因子升高及抗炎因子的下調。結論:大鼠ka癲癇模型具有理想的顳葉癲癇的特征。ka注射后大鼠海馬表現(xiàn)出廣泛的細胞因子改變,包括促炎細胞因子在造模后短期內即出現(xiàn)表達上調,及抗炎細胞因子表達下調。這些細胞因子都可通過jak-stat通路、pi3k-akt通路、mapk信號通路等信號通路影響cox-2信號通路或被其影響。大黃素能抑制異常癲癇波發(fā)放,降低癲癇發(fā)作強度,并能抑制ka腹腔注射導致的促炎因子升高及抗炎因子的下調。同時,癲癇后細胞膜糖蛋白正向調節(jié)因子表達增加,負向調節(jié)因子表達降低。提示大鼠腦組織炎性反應的過程同時伴隨著細胞膜糖蛋白的合成被增強。同樣,這種糖蛋白合成可以被大黃素抑制。第二部分大黃素對癲癇耐藥性的影響機制目的:驗證ka點燃的慢性癲癇模型中是否存在p-gp的表達增高,這種高表達能否被大黃素抑制。通過免疫組織化學方法、蛋白定量方法檢測大黃素對cox-2及nmda受體的影響,以及三者對p-gp的影響,從而深入探討大黃素治療難治性癲癇的分子機制。方法:大鼠分為正常對照組(c組)、模型組(m組)、大黃素治療組(e組)、苯妥英鈉治療組(p組)、聯(lián)合治療組(s組)。m組、e組、p組、s組大鼠每日10時腹腔注射6mg/kg的海人酸,連續(xù)注射7天,建立慢性點燃模型。產生5次連續(xù)的2級癲癇或4次連續(xù)的3級癲癇視為點燃成功,以點燃成功記為第0天。點燃成功后,e組大鼠每日腹腔注射50mg/kg的大黃素注射液,p組大鼠每日給予40mg/kg苯妥英鈉灌胃,1次/日。s組每日給予40mg/kg苯妥英鈉灌胃,同時腹腔注射50mg/kg的大黃素注射液。于第3、6、9、12天將大鼠斷首,將腦組織進行腦毛細血管分離,取毛細血管上懸液與nbd-csa在共聚焦密閉槽內共孵育,應用激光共聚焦顯微鏡對毛細血管進行觀察,毛細血管腔內nbd-csa熒光密度應用軟件進行定量分析。應用免疫組織化學方法檢測癲癇發(fā)生后海馬cox-2、p-gp、nmda受體的表達改變及大黃素對其的影響。應用western-blot檢測癲癇發(fā)生后海馬cox-2、p-gp、nmda受體蛋白的定量改變及大黃素對其的影響。在轉錄水平應用rt-pcr方法檢測癲癇發(fā)生后海馬cox-2、p-gp、nmda受體mrna的定量改變及大黃素對其的影響。結果:隨著癲癇時間的延長,大鼠腦毛細血管p-gp的表達會逐漸增高,其熒光強度也隨之增加,9天達到峰值,其后開始下降,分別為3d(98.8±17.4)、6d(118.8±14.4)、9d(153.8±6.67)、12d(144.7±5.25)。對照組大鼠海馬有極少cox-2蛋白表達,陽性細胞主要分布于齒狀回、ca3和ca4區(qū)。m組ka反復注射后cox-2陽性細胞數(shù)明顯增高,主要位于ca3及ca4區(qū),在第3、6、9、12天無明顯差異。在p組cox-2陽性細胞數(shù)也明顯增高,變化規(guī)律及陽性單位數(shù)與m組無差異。e組及s組ca3及ca4區(qū)陽性細胞數(shù)較m組明顯減少。對照組大鼠海馬各部位均有p-gp蛋白表達,均分布于毛細血管內皮細胞。m組ka反復注射后p-gp陽性單位明顯增高,分布于海馬各區(qū),在第3、6、9、12天無明顯差異。在p組p-gp陽性細胞數(shù)也明顯增高,變化規(guī)律及陽性單位數(shù)與m組無差異。e組及s組p-gp陽性單位較m組明顯減少。對照組大鼠海馬各部位均有nmda受體的表達。m組、e組、p組及s組nmda受體陽性單位均明顯增高,分布于海馬各區(qū),在第3、6、9、12天無明顯差異。western-blot蛋白定量結果:cox-2的表達與p-gp的表達趨勢相同,m組及p組與c組比較顯著升高(p0.05),m組與p組比較無明顯差異(p0.05),e組及s組較m組下降(p0.05),與c組無明顯差異(p0.05);nmda受體的表達呈現(xiàn)出m組、c組、p組及s組與c組比較顯著升高(p0.05),之間表達無明顯差異(p0.05)。rt-pcr結果:m組及p組mdr1、cox-2基因的擴增倍數(shù)最高,與c、e、s組比較均有統(tǒng)計學差異(p0.05)。mdr1、cox-2基因的擴增趨勢相同。nmda受體的擴增在m、e、p、s組均顯著增高,與c組比較均有統(tǒng)計學差異(p0.05)。結論:ka反復腹腔注射所致慢性癲癇后,大鼠腦毛細血管p糖蛋白的表達會逐漸增高。癲癇發(fā)生后海馬cox-2蛋白、p-gp及nmda受體的表達的持續(xù)增加,p-gp與cox-2表達規(guī)律一致,其高表達與苯妥英鈉治療無關,能被大黃素抑制。nmda受體的高表達不能被苯妥英鈉及大黃素抑制。大黃素可能通過cox-2途徑影響p-gp的表達,但并非通過抑制谷氨酸與nmda受體結合途徑影響cox-2從而影響p-gp的表達。結論1.ka癲癇模型模型具有理想的顳葉癲癇的特征。ka注射后大鼠海馬表現(xiàn)出廣泛的細胞因子改變,包括促炎細胞因子il-2、il-3、il-4、il-5、il-12、il-13、tgf-β1、tgf-β2等在造模后短期內即出現(xiàn)表達上調,24小時逐漸恢復正常,以及抗炎細胞因子b7-1/cd80、cntf、cntfr、basic-fgf、csk出現(xiàn)表達下調。這些細胞因子都通過jak-stat通路、pi3k-akt通路、mapk信號通路等信號通路影響cox-2信號通路或被其影響。大黃素能抑制ka腹腔注射導致的促炎因子升高及抗炎因子的下調。2.ka反復腹腔注射所致慢性癲癇后,大鼠腦毛細血管p糖蛋白的表達會逐漸增高。癲癇發(fā)生后海馬cox-2蛋白、p-gp及nmda受體的表達的持續(xù)增加,p-gp與COX-2表達規(guī)律一致,其高表達與苯妥英鈉治療無關,能被大黃素抑制。NMDA受體的高表達不能被苯妥英鈉及大黃素抑制。大黃素可能通過COX-2途徑影響P-gp的表達,但并非通過抑制谷氨酸與NMDA受體結合途徑影響COX-2從而影響P-gp的表達。3.應用大黃素處理后大鼠表現(xiàn)出癲癇發(fā)作級別降低,腦電圖提示棘波、尖波等癲癇波發(fā)放減少。大黃素能夠促進抗癲癇藥物苯妥英鈉的抗癲癇作用。
【關鍵詞】：難治性癲癇 炎癥 細胞因子 大黃素 P糖蛋白 環(huán)氧酶-2
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R285
【目錄】：