本文關(guān)鍵詞：大黃素通過(guò)炎癥信號(hào)通路調(diào)控癲癇發(fā)生及耐藥機(jī)制的初步研究

  更多相關(guān)文章： 難治性癲癇 炎癥 細(xì)胞因子 大黃素 P糖蛋白 環(huán)氧酶-2

【摘要】：癲癇是一組由大腦神經(jīng)元反復(fù)異常同步化放電所引起的短暫中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。全球有約超過(guò)4000萬(wàn)癲癇患者,我國(guó)約有600萬(wàn)癲癇患者。大多數(shù)的癲癇患者經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的規(guī)范藥物治療后,癇性發(fā)作可以得到控制。但是仍有20%-30%的患者藥物治療并不能夠減輕發(fā)作的頻率和強(qiáng)度,被稱為難治性癲病。闡明難治性癲癇的發(fā)生機(jī)制,提高癲癇發(fā)作控制率一直是癲癇研究的熱點(diǎn)。以往的研究中,離子通道異常、神經(jīng)遞質(zhì)異常、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重組、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、線粒體功能異常、自身抗體等是癲癇機(jī)制研究的重點(diǎn)。近年來(lái)大量研究已經(jīng)表明炎癥是癲癇產(chǎn)生和癲癇發(fā)作的關(guān)鍵因素之一。細(xì)胞因子是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的最基本物質(zhì),大量細(xì)胞因子與受體結(jié)合后通過(guò)開(kāi)放離子通道、激活下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)等方式產(chǎn)生廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。癲癇發(fā)生中小膠質(zhì)細(xì)胞及星形細(xì)胞的活化,釋放IL-1β、TNFα等促炎細(xì)胞因子,隨之這些因子觸發(fā)神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、血腦屏障等多處的炎癥信號(hào)通路,如NF-κB、COX-2、補(bǔ)體系統(tǒng)、TLR信號(hào)通路引起廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。炎性反應(yīng)及炎癥因子參與了神經(jīng)遞質(zhì)的失衡、突觸傳遞的異常、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的重構(gòu)、血腦屏障的破壞等過(guò)程,最終導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性增高、癲癇發(fā)作閾值降低。目前IL-1β、IL-6、TNFα、HMGB1等因子的作用研究較為深入,發(fā)現(xiàn)癲癇發(fā)生中新的細(xì)胞因子意味著發(fā)現(xiàn)了新的治療靶點(diǎn),開(kāi)啟新的治療途徑。除了癲癇的發(fā)生機(jī)制外,難治性癲癇的另一個(gè)重要研究方向是癲癇“耐藥性”的形成機(jī)制。近年來(lái)受到腫瘤多藥耐藥機(jī)制的啟示,多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體在癲癇患者腦內(nèi)的表達(dá)越來(lái)越受到關(guān)注。P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)是其中發(fā)揮最主要作用的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。大量癲癇動(dòng)物模型及癲癇患者腦組織的研究表明,P-gp在神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞、腦實(shí)質(zhì)和血管周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)增高,這種過(guò)度表達(dá)與難治性癲癇的多藥耐藥性呈正相關(guān)。近年來(lái)對(duì)多藥耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控機(jī)制的研究提示COX-2可能是調(diào)控P-gp合成的關(guān)鍵因素。COX-2催化的前列腺素E2生成及其他下游反應(yīng)是諸多炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),這提示多藥耐藥的形成、P-gp的表達(dá)與炎癥也有密切的關(guān)系。我們的前期研究通過(guò)腦電分析發(fā)現(xiàn)大黃對(duì)癲癇具有抑制作用,其機(jī)制可能是大黃素抑制突觸前興奮性氨基酸遞質(zhì)的釋放直接抑制海馬ca1區(qū)錐體神經(jīng)元epsp,降低由于谷氨酸和nmda受體介導(dǎo)的興奮毒性增高,大黃素可減輕腦水腫、升高sod、na+-k+atp酶活性,降低mda水平,影響多個(gè)病理生理通路。大黃素的抗炎作用以被越來(lái)越多的研究證實(shí),大黃素對(duì)諸多炎癥因子、信號(hào)通路都有較為明確的作用。這就提示我們大黃素可能對(duì)癲癇的耐藥有一定作用,其機(jī)制可能是通過(guò)cox-2等炎癥通路實(shí)現(xiàn)。本論文分為兩個(gè)部分,具體如下:第一部分大黃素通過(guò)炎癥信號(hào)通路對(duì)癲癇的調(diào)控目的:建立海人酸(kainicacid,ka)注射大鼠癲癇模型,并以大黃素進(jìn)行干預(yù),通過(guò)高通量細(xì)胞因子蛋白芯片分析正常大鼠、ka致癇大鼠及經(jīng)大黃素處理的癲癇大鼠海馬組織細(xì)胞因子的差異表達(dá),分析ka致癇后細(xì)胞因子的改變及大黃素的影響,尋找新的分子治療靶點(diǎn)。方法:大鼠分為正常對(duì)照組(c組),模型組(m組),大黃素干預(yù)組(t組)。c組為正常大鼠無(wú)處理,m、t組大鼠腹腔注射12mg/kg的海人酸,t組大鼠腹腔注射海人酸10分鐘后腹腔注射大黃素(200mg/kg)。根據(jù)racine評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)判定癲癇發(fā)作級(jí)別,大鼠進(jìn)行腦電圖描記。采用he染色及透射電鏡對(duì)大鼠海馬病理學(xué)改變進(jìn)行觀察。取大鼠海馬組織進(jìn)行蛋白提取,應(yīng)用bca法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。采用raybio?大鼠l系列抗體芯片i(90)定量檢測(cè)細(xì)胞因子表達(dá)情況。結(jié)果:ka注射后大鼠表現(xiàn)出癲癇發(fā)作癥狀,腦電圖出現(xiàn)叢集性、陣發(fā)性發(fā)作的棘波、尖波等癲癇樣波,大黃素組大鼠表現(xiàn)出現(xiàn)癲癇發(fā)作racine分級(jí)較模型組降低。he染色示ka注射后8小時(shí),大鼠海馬ca3、ca4區(qū)神經(jīng)元開(kāi)始出現(xiàn)壞死、凋亡、丟失,48小時(shí)達(dá)到頂峰,此后ca3、ca4區(qū)神經(jīng)元維持穩(wěn)定,而海馬齒狀回顆粒層神經(jīng)元未見(jiàn)明顯減少。蛋白芯片結(jié)果提示,ka注射后大鼠海馬表現(xiàn)出廣泛的細(xì)胞因子改變,包括促炎細(xì)胞因子il-2、il-3、il-4、il-5、il-12、il-13、tgf-β1、tgf-β2等在造模后短期內(nèi)即出現(xiàn)表達(dá)上調(diào),24小時(shí)逐漸恢復(fù)正常,以及抗炎細(xì)胞因子b7-1/cd80、cntf、cntfr、basic-fgf、csk出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)。細(xì)胞膜糖蛋白正向調(diào)節(jié)因子tgf-β1、tgf-β2、rage在ka注射后表達(dá)增加,糖蛋白負(fù)向調(diào)節(jié)因子fractalkine表達(dá)降低。大黃素能抑制ka腹腔注射導(dǎo)致的促炎因子升高及抗炎因子的下調(diào)。結(jié)論:大鼠ka癲癇模型具有理想的顳葉癲癇的特征。ka注射后大鼠海馬表現(xiàn)出廣泛的細(xì)胞因子改變,包括促炎細(xì)胞因子在造模后短期內(nèi)即出現(xiàn)表達(dá)上調(diào),及抗炎細(xì)胞因子表達(dá)下調(diào)。這些細(xì)胞因子都可通過(guò)jak-stat通路、pi3k-akt通路、mapk信號(hào)通路等信號(hào)通路影響cox-2信號(hào)通路或被其影響。大黃素能抑制異常癲癇波發(fā)放,降低癲癇發(fā)作強(qiáng)度,并能抑制ka腹腔注射導(dǎo)致的促炎因子升高及抗炎因子的下調(diào)。同時(shí),癲癇后細(xì)胞膜糖蛋白正向調(diào)節(jié)因子表達(dá)增加,負(fù)向調(diào)節(jié)因子表達(dá)降低。提示大鼠腦組織炎性反應(yīng)的過(guò)程同時(shí)伴隨著細(xì)胞膜糖蛋白的合成被增強(qiáng)。同樣,這種糖蛋白合成可以被大黃素抑制。第二部分大黃素對(duì)癲癇耐藥性的影響機(jī)制目的:驗(yàn)證ka點(diǎn)燃的慢性癲癇模型中是否存在p-gp的表達(dá)增高,這種高表達(dá)能否被大黃素抑制。通過(guò)免疫組織化學(xué)方法、蛋白定量方法檢測(cè)大黃素對(duì)cox-2及nmda受體的影響,以及三者對(duì)p-gp的影響,從而深入探討大黃素治療難治性癲癇的分子機(jī)制。方法:大鼠分為正常對(duì)照組(c組)、模型組(m組)、大黃素治療組(e組)、苯妥英鈉治療組(p組)、聯(lián)合治療組(s組)。m組、e組、p組、s組大鼠每日10時(shí)腹腔注射6mg/kg的海人酸,連續(xù)注射7天,建立慢性點(diǎn)燃模型。產(chǎn)生5次連續(xù)的2級(jí)癲癇或4次連續(xù)的3級(jí)癲癇視為點(diǎn)燃成功,以點(diǎn)燃成功記為第0天。點(diǎn)燃成功后,e組大鼠每日腹腔注射50mg/kg的大黃素注射液,p組大鼠每日給予40mg/kg苯妥英鈉灌胃,1次/日。s組每日給予40mg/kg苯妥英鈉灌胃,同時(shí)腹腔注射50mg/kg的大黃素注射液。于第3、6、9、12天將大鼠斷首,將腦組織進(jìn)行腦毛細(xì)血管分離,取毛細(xì)血管上懸液與nbd-csa在共聚焦密閉槽內(nèi)共孵育,應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡對(duì)毛細(xì)血管進(jìn)行觀察,毛細(xì)血管腔內(nèi)nbd-csa熒光密度應(yīng)用軟件進(jìn)行定量分析。應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)癲癇發(fā)生后海馬cox-2、p-gp、nmda受體的表達(dá)改變及大黃素對(duì)其的影響。應(yīng)用western-blot檢測(cè)癲癇發(fā)生后海馬cox-2、p-gp、nmda受體蛋白的定量改變及大黃素對(duì)其的影響。在轉(zhuǎn)錄水平應(yīng)用rt-pcr方法檢測(cè)癲癇發(fā)生后海馬cox-2、p-gp、nmda受體mrna的定量改變及大黃素對(duì)其的影響。結(jié)果:隨著癲癇時(shí)間的延長(zhǎng),大鼠腦毛細(xì)血管p-gp的表達(dá)會(huì)逐漸增高,其熒光強(qiáng)度也隨之增加,9天達(dá)到峰值,其后開(kāi)始下降,分別為3d(98.8±17.4)、6d(118.8±14.4)、9d(153.8±6.67)、12d(144.7±5.25)。對(duì)照組大鼠海馬有極少cox-2蛋白表達(dá),陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于齒狀回、ca3和ca4區(qū)。m組ka反復(fù)注射后cox-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增高,主要位于ca3及ca4區(qū),在第3、6、9、12天無(wú)明顯差異。在p組cox-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)也明顯增高,變化規(guī)律及陽(yáng)性單位數(shù)與m組無(wú)差異。e組及s組ca3及ca4區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較m組明顯減少。對(duì)照組大鼠海馬各部位均有p-gp蛋白表達(dá),均分布于毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞。m組ka反復(fù)注射后p-gp陽(yáng)性單位明顯增高,分布于海馬各區(qū),在第3、6、9、12天無(wú)明顯差異。在p組p-gp陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)也明顯增高,變化規(guī)律及陽(yáng)性單位數(shù)與m組無(wú)差異。e組及s組p-gp陽(yáng)性單位較m組明顯減少。對(duì)照組大鼠海馬各部位均有nmda受體的表達(dá)。m組、e組、p組及s組nmda受體陽(yáng)性單位均明顯增高,分布于海馬各區(qū),在第3、6、9、12天無(wú)明顯差異。western-blot蛋白定量結(jié)果:cox-2的表達(dá)與p-gp的表達(dá)趨勢(shì)相同,m組及p組與c組比較顯著升高(p0.05),m組與p組比較無(wú)明顯差異(p0.05),e組及s組較m組下降(p0.05),與c組無(wú)明顯差異(p0.05);nmda受體的表達(dá)呈現(xiàn)出m組、c組、p組及s組與c組比較顯著升高(p0.05),之間表達(dá)無(wú)明顯差異(p0.05)。rt-pcr結(jié)果:m組及p組mdr1、cox-2基因的擴(kuò)增倍數(shù)最高,與c、e、s組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。mdr1、cox-2基因的擴(kuò)增趨勢(shì)相同。nmda受體的擴(kuò)增在m、e、p、s組均顯著增高,與c組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。結(jié)論:ka反復(fù)腹腔注射所致慢性癲癇后,大鼠腦毛細(xì)血管p糖蛋白的表達(dá)會(huì)逐漸增高。癲癇發(fā)生后海馬cox-2蛋白、p-gp及nmda受體的表達(dá)的持續(xù)增加,p-gp與cox-2表達(dá)規(guī)律一致,其高表達(dá)與苯妥英鈉治療無(wú)關(guān),能被大黃素抑制。nmda受體的高表達(dá)不能被苯妥英鈉及大黃素抑制。大黃素可能通過(guò)cox-2途徑影響p-gp的表達(dá),但并非通過(guò)抑制谷氨酸與nmda受體結(jié)合途徑影響cox-2從而影響p-gp的表達(dá)。結(jié)論1.ka癲癇模型模型具有理想的顳葉癲癇的特征。ka注射后大鼠海馬表現(xiàn)出廣泛的細(xì)胞因子改變,包括促炎細(xì)胞因子il-2、il-3、il-4、il-5、il-12、il-13、tgf-β1、tgf-β2等在造模后短期內(nèi)即出現(xiàn)表達(dá)上調(diào),24小時(shí)逐漸恢復(fù)正常,以及抗炎細(xì)胞因子b7-1/cd80、cntf、cntfr、basic-fgf、csk出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)。這些細(xì)胞因子都通過(guò)jak-stat通路、pi3k-akt通路、mapk信號(hào)通路等信號(hào)通路影響cox-2信號(hào)通路或被其影響。大黃素能抑制ka腹腔注射導(dǎo)致的促炎因子升高及抗炎因子的下調(diào)。2.ka反復(fù)腹腔注射所致慢性癲癇后,大鼠腦毛細(xì)血管p糖蛋白的表達(dá)會(huì)逐漸增高。癲癇發(fā)生后海馬cox-2蛋白、p-gp及nmda受體的表達(dá)的持續(xù)增加,p-gp與COX-2表達(dá)規(guī)律一致,其高表達(dá)與苯妥英鈉治療無(wú)關(guān),能被大黃素抑制。NMDA受體的高表達(dá)不能被苯妥英鈉及大黃素抑制。大黃素可能通過(guò)COX-2途徑影響P-gp的表達(dá),但并非通過(guò)抑制谷氨酸與NMDA受體結(jié)合途徑影響COX-2從而影響P-gp的表達(dá)。3.應(yīng)用大黃素處理后大鼠表現(xiàn)出癲癇發(fā)作級(jí)別降低,腦電圖提示棘波、尖波等癲癇波發(fā)放減少。大黃素能夠促進(jìn)抗癲癇藥物苯妥英鈉的抗癲癇作用。
【關(guān)鍵詞】：難治性癲癇 炎癥 細(xì)胞因子 大黃素 P糖蛋白 環(huán)氧酶-2
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R285
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-6
• 英文摘要6-11
• 中文摘要11-16
• 前言16-21
• 總材料與方法21-27
• 第一部分 大黃素通過(guò)炎癥信號(hào)通路對(duì)癲癇的調(diào)控27-86
• 引言27-29
• 第一章 KA癲癇模型的建立及大黃素對(duì)癲癇發(fā)作的影響29-38
• 1.1 材料與方法29-31
• 1.2 結(jié)果31-36
• 1.3 討論36-37
• 1.4 小結(jié)37-38
• 第二章 大黃素對(duì)癲癇炎癥信號(hào)通路的調(diào)控38-86
• 2.1 材料與方法38-41
• 2.2 結(jié)果41-80
• 2.3 討論80-85
• 2.4 小結(jié)85-86
• 第二部分 大黃素對(duì)癲癇耐藥性的影響機(jī)制86-108
• 引言86-87
• 1.1 材料和方法87-92
• 1.2 結(jié)果92-104
• 1.3 討論104-106
• 1.4 小結(jié)106-108
• 全文總結(jié)108-109
• 參考文獻(xiàn)109-120
• 文獻(xiàn)綜述 炎癥因子及其信號(hào)通路在癲癇中的作用120-133
• 參考文獻(xiàn)126-133
• 攻讀博士期間發(fā)表論文及參與課題情況133-135
• 致謝135

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：933199