本文關(guān)鍵詞：人臍帶間充質(zhì)干細胞移植對腦出血后細胞凋亡的影響

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【摘要】：背景腦出血是一種高發(fā)病率、高致殘率和高病死率的腦血管疾病。在亞洲國家,腦出血占所有卒中的20-30%,其中有30-40%在急性期死亡。腦出血后引起血腫周圍腦組織損傷,主要由于血腫的占位效應(yīng)和直接損傷,其他包括血腫周圍組織缺血、繼發(fā)炎癥反應(yīng)、紅細胞溶解產(chǎn)生的血紅蛋白所誘導(dǎo)的毒性反應(yīng)直接破壞周圍腦組織,神經(jīng)元凋亡及等因素引起腦組織水腫、移位和損傷,其中P53,Bcl-2和Bax基因在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用,從而出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損癥狀和體征。因此,研究腦出血的治療非常重要。近年來,腦出血微創(chuàng)清除術(shù)受到關(guān)注,微創(chuàng)治療可以在腦出血早期減輕血腫對周圍腦組織的壓迫,解除占位效應(yīng),減少炎癥介質(zhì),避免直接的化學(xué)刺激,從而緩解腦組織繼發(fā)損傷。但神經(jīng)元是不可再生細胞,單純血腫抽吸治療腦出血,并不能從根本上促進神經(jīng)功能的恢復(fù)。臍帶血間充質(zhì)干細胞(HUC-MSCs)具有多項分化潛能,HUC-MSCs用于腦卒中的治療實驗研究表明,神經(jīng)生長因子的分泌,減輕炎癥反應(yīng),減少細胞凋亡等機制促進了神經(jīng)功能恢復(fù)。目的本實驗采用微創(chuàng)血腫清除術(shù)、微創(chuàng)血腫清除術(shù)聯(lián)合臍帶間充質(zhì)干細胞移植治療大鼠出血性腦卒中,探討HUC-MSCs細胞移植對細胞凋亡和對神經(jīng)功能恢復(fù)的影響,探索治療方案可行性,為急性期臨床治療出血性腦卒中提供實驗依據(jù)。方法共納入120只SD大鼠,隨機分為4組：(1)對照組(Control組)：用骨鉆在顱骨鉆孔,于定位穿刺點用微量進樣器穿刺右側(cè)尾狀核區(qū)；(2)腦出血組(ICH組)：麻醉后固定于腦立體定位儀,骨鉆定位鉆孔,于穿刺點用微量進樣器注射Ⅳ型膠原酶入右側(cè)尾狀核區(qū)；(3)微創(chuàng)血腫清除組(MIS組)腦出血大鼠模型造模成功6小時后,用自制血腫清除裝置行微創(chuàng)血腫清除術(shù)；(4)細胞移植治療組(MSC組)腦出血大鼠模型行微創(chuàng)血腫清除術(shù)后同部位注入HUC-MSCs懸液。每組大鼠分別于ICH建模后1d、2d、5d、9d、14d和21d處死,每個時間點5只大鼠。臍帶取自足月剖宮產(chǎn)健康產(chǎn)婦,分離、培養(yǎng)、分化干細胞,BrdU標記HUC-MSCs。腦出血模型制備成功后6h行微創(chuàng)血腫清除術(shù)和HUC-MSCs移植。肝素化生理鹽水注入右心耳,大鼠僵化后斷頭取腦,固定腦組織。腦組織切片以備免疫組織化學(xué)染色。檢測細胞CD29,CD34,CD44,CD90和CD105的表達,鑒定間充質(zhì)干細胞。檢測P53, Bcl-2和Bax在腦組織的表達,反映細胞凋亡情況。采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析。檢測數(shù)據(jù)以均值±標準差(x±s)方式表示,P0.05時被認為組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果經(jīng)分離培養(yǎng)的HUC-MSCs干細胞,在顯微鏡下呈長纖維狀排列。HUC-MSCs細胞體外分離、培養(yǎng)、免疫細胞化學(xué)染色,通過觀察,CD44、CD29、CD90、CD105陽性表達,而CD34陰性表達,表明分離培養(yǎng)的細胞符合間充質(zhì)干細胞的特點,鑒定為HUC-MSCs干細胞。共計120只腦出血模型大鼠Bederson評分大于2分,建模成功。大鼠移植血腫部位接受BrdU標記的HUC-MSCs細胞移植后,采用免疫組織化學(xué)的方法進行研究,發(fā)現(xiàn)在1d到21d均可見到BrdU染色陽性的細胞,并且在血腫周圍組織、顳葉海馬區(qū)及大腦皮質(zhì)區(qū)有染色陽性細胞,而Control組、ICH組和MIS組腦組織內(nèi)免疫組化未顯示陽性細胞,表明在細胞移植后,HUC-MSCs細胞能夠成活并遷徙到血腫附近及遠隔組織。ICH組、MIS組和MSC組在每個時間點mNSS評分均顯著低于control組(P0.05)；從2d開始,MIS組和MSC組在每個時間點mNSS評分均顯著低于ICH組(P0.05)；MSC組較MIS組在5d、9d、14d和21d評分低(P0.05)。腦組織免疫組化結(jié)果顯示,腦出血后3個干預(yù)組與對照組相比,在每個時間點P53表達陽性數(shù)均有明顯差別(P0.05)；MSC組在1d、2 d時與MIS組之間無統(tǒng)計學(xué)差異,MSC組在5d、9d、14d和21d時P53陽性表達低于MIS組(P0.05),在2d、5d、9d、14d和21 d時,MIS組P53陽性表達低于ICH組(P0.05)。與對照組相比,從術(shù)后5d開始,ICH組、MIS組和MSC組在每個時間點Bcl-2表達陽性率均有明顯增強(P0.05)；MSC組在9d、14d和21d時Bcl-2陽性表達明顯高于MIS組(P0.05)；MIS組Bcl-2陽性表達在5d、9d、14d和21d時高于ICH組。MSC組在5d、9d、14d和21d時陽性表達低于MIS組(P0.05),在2d、5d、9d、14d和21d時,MIS組Bax陽性表達低于ICH組(P0.05)。腦出血后P53和Bax的表達在1d達高峰,第5d表達逐漸減少。Bcl-2的表達在2d時達高峰,第5d維持在高表達狀態(tài),隨后表達逐漸減少。結(jié)論腦出血導(dǎo)致血腫周圍腦組織凋亡相關(guān)基因的表達。細胞移植后,HUC-MSCs細胞可以在血腫周圍存活并遷移到遠隔組織。P53、Bax、Bcl-2表達主要集中于血腫周圍組織、皮質(zhì)、皮質(zhì)下和海馬區(qū)的胞漿內(nèi)。微創(chuàng)血腫清除和微創(chuàng)術(shù)后HUC-MSCs細胞移植都增加血腫周圍腦組織Bcl-2表達,降低P53、Bax陽性表達。微創(chuàng)術(shù)后HUC-MSCs細胞移植比單純血腫清除術(shù)期更有效的降低細胞凋亡。血腫清除及人臍帶血間充質(zhì)干細胞移植有效降低P53及Bax表達,提高Bcl-2表達陽性率,血腫清除后行人臍帶血間充質(zhì)干細胞移植對減少細胞凋亡,促進神經(jīng)功能的恢復(fù)更有效。本實驗為臨床治療腦出血提供依據(jù),需要更深入研究證實。
【關(guān)鍵詞】：臍帶間充質(zhì)干細胞 微創(chuàng)血腫清除術(shù) 腦出血
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R743.34
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符號說明13-14
• 前言14-17
• 材料與方法17-24
• 結(jié)果24-27
• 討論27-37
• 結(jié)論37-38
• 附圖38-41
• 附表41-45
• 參考文獻45-50
• 致謝50-51
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文51-52
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表52-53
• 外文論文53-121

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 竇慧慧;郭文君;于麗;馬麗;孫麗;;人臍帶間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)方法的研究[J];中國組織化學(xué)與細胞化學(xué)雜志;2010年02期

2 李紅玲;樊金蘭;陳維;;腦出血實驗動物模型[J];神經(jīng)損傷與功能重建;2006年04期

3 侯克東;盧世璧;張莉;袁玫;孫明學(xué);彭江;趙斌;眭翔;許文靜;;人臍帶Wharton膠中間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2008年04期

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本文編號：931050