本文關鍵詞：miRNA-155介導ESAT-6誘導巨噬細胞凋亡的分子機制及其在結核診斷中的作用

  更多相關文章： 凋亡 早期分泌抗原6 微小RNA-155 核轉錄因子-κB 細胞因子信號抑制因子-1 Toll樣受體-2 結核病

【摘要】：研究背景:結核感染仍是世界公共衛(wèi)生難題,據(jù)2014年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)統(tǒng)計:2013年約有900萬新增活動型結核病人,其中高達150萬人因結核病而喪命。近年來隨著多重耐藥結核、廣泛性耐藥結核病的出現(xiàn)以及HIV-TB的合并感染,更加劇了目前結核病防控的嚴峻形勢。結核病的主要致病菌為結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb),其主要潛伏感染人巨噬細胞,并引起宿主細胞壞死裂解。抗結核免疫應答是機體清除結核分枝桿菌的重要環(huán)節(jié)。除作為Mtb的主要感染細胞,巨噬細胞同樣也是機體殺死結核分枝桿菌的重要效應細胞。已有研究表明:細胞凋亡在機體抗結核固有免疫應答中發(fā)揮重要作用,Mtb減毒株或無毒株可促進細胞凋亡發(fā)生,控制結核感染;然而Mtb強毒株可抑制凋亡并誘導細胞壞死,引起結核擴散。結核早期分泌抗原ESAT-6,作為結核分枝桿菌的重要毒力因子,在免疫調(diào)節(jié)中亦發(fā)揮重要作用。已有研究顯示:結核早期分泌抗原ESAT-6能夠促進巨噬細胞凋亡,有利于機體清除結核分枝桿菌,但其相關分子機制并不十分清楚。在前期預實驗中,我們發(fā)現(xiàn):ESAT-6抗原刺激巨噬細胞后,能引起胞內(nèi)mi R-155表達顯著升高,相關研究報道m(xù)i R-155參與了卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)介導的巨噬細胞凋亡,通過生物信息學預測分析,我們發(fā)現(xiàn)細胞信號抑制分子-1(suppressor of cytokine signaling-1,SOCS1)是mi R-155的一個重要靶基因,且已有證據(jù)表明SOCS1可能是Mtb感染時巨噬細胞中調(diào)節(jié)細胞因子信號通路的一個關鍵分子,由此,我們推測mi R-155與SOCS1相互作用可能參與了結核早期分泌抗原ESAT-6介導的巨噬細胞凋亡過程。本研究擬在已有研究報道和我們前期工作基礎上開展如下工作:(1)明確結核抗原ESAT6處理巨噬細胞后,巨噬細胞內(nèi)mi R-155、SOCS1的動態(tài)變化和時間特異性;(2)應用慢病毒轉染控制mi R-155及SOCS1表達,探討ESAT-6處理后,巨噬細胞中凋亡分子Caspase-3表達情況,明確mi R-155及SOCS1在巨噬細胞凋亡中的作用;同時采用si RNA干擾技術控制Toll樣受體2(Toll-like receptor 2,TLR2)及NF-κB p65表達,初步探討ESAT-6誘導mi R-155表達上調(diào)的原因;(3)收集人外周血單個核細胞,熒光定量PCR檢測特定免疫分子及細胞因子表達情況,探討其在結核診斷中的作用。本研究力圖為闡明ESAT-6在宿主免疫調(diào)節(jié)中的作用提供新的理論依據(jù),同時亦為尋找新的結核病干預靶點及臨床結核病診治提供新的思路。方法:1.應用結核早期分泌抗原ESAT-6處理巨噬細胞系RAW264.7,收集經(jīng)處理后不同時間點細胞總RNA及蛋白,實時熒光定量PCR技術檢測胞內(nèi)mi R-155、BIC、SOCS1、IL6及TNF-α及IFN-γ等m RNA表達水平;Western-blot技術檢測SOCS1、NF-κB p65及凋亡分子Caspase-3蛋白表達水平;同時,采用流式細胞儀檢測不同時間點細胞凋亡發(fā)生情況;2.采用慢病毒過表達mi R-155及抑制mi R-155,實時熒光定量PCR技術檢測胞內(nèi)SOCS1、IL6及TNF-αm RNA表達變化;Western-blot技術檢測SOCS1及凋亡分子Caspase-3蛋白表達水平變化;并用流式細胞儀分析抑制mi R-155后對細胞凋亡的影響;3.采用慢病毒過表達SOCS1基因,Western-blot技術檢測凋亡分子Caspase-3蛋白表達水平;同時在過表達SOCS1的條件下,Western-blot技術及流式細胞術觀察mi R-155對巨噬細胞凋亡的影響;4.為了進一步弄清楚ESAT-6誘導mi R-155表達上調(diào)的主要原因,我們采用了si RNA干擾技術,控制RAW264.7細胞內(nèi)TLR2及NF-κB p65的表達,并用Western-blot技術觀察TLR2及NF-κB p65干擾效果,以及實時熒光定量PCR技術檢測細胞內(nèi)mi R-155表達水平;5.將研究人群分為三個組:正常對照組、活動型結核組及潛伏型結核組。收集人外周血單個核細胞,提取總RNA,采用實時熒光定量PCR技術檢測特定免疫分子(TLR2、BIC、mi R-155、SOCS1)及細胞因子(TNFα、IL6、IL12p40、i NOS、IFN-γ)m RNA表達水平。結果:1.ESAT-6處理巨噬細胞24h內(nèi),細胞凋亡分子活性Caspase-3表達不斷增加;流式細胞檢測結果亦表明ESAT-6能夠顯著促進巨噬細胞凋亡發(fā)生,并有時間依賴效應;此外,研究結果顯示mi R-155、BIC及相關細胞因子m RNA表達水平隨ESAT-6處理時間不斷增加,而SOCS1表達水平隨時間增加而不斷下降;2.單獨過表達mi R-155能顯著抑制SOCS1表達,提高巨噬細胞凋亡分子Cleaved Caspase-3表達,并促進巨噬細胞凋亡發(fā)生。采用慢病毒抑制mi R-155表達,巨噬細胞內(nèi)SOCS1表達明顯升高,而細胞因子如IL6,TNF-α等表達顯著減少,細胞凋亡受到明顯抑制;3.過表達SOCS1基因可抑制ESAT-6介導的巨噬細胞凋亡;而在過表達SOCS1條件下,過表達mi R-155則可恢復Cleaved Caspase-3表達及大部分巨噬細胞凋亡的發(fā)生。4.成功構建TLR2及NF-κB p65-si RNA干擾細胞系,結果發(fā)現(xiàn)抑制TLR2表達能顯著降低ESAT-6介導的NF-κB p65表達,并干擾細胞內(nèi)mi R-155的表達,提示TLR2/NF-κB活化可能是ESAT-6誘導mi R-155表達上調(diào)的主要原因。5.Q-PCR檢測人外周血單個核細胞中特定免疫調(diào)節(jié)分子(TLR2,BIC,mi R-155及SOCS1)和細胞因子結果表明:TLR2,BIC,mi R-155以及SOCS1在各組別中差異表達,進一步統(tǒng)計分析提示mi R-155/SOCS1比值可能區(qū)分活動型結核及潛伏型結核感染。結論:1.mi R-155在ESAT-6介導的巨噬細胞免疫活化及凋亡過程中具有重要作用;2.mi R-155可能通過靶向作用SOCS1參與調(diào)控結核早期分泌抗原ESAT-6介導的巨噬細胞凋亡發(fā)生;3.ESAT-6誘導的mi R-155表達上調(diào)與巨噬細胞內(nèi)TLR2/NF-κB活化相關;4.TLR2,BIC,mi R-155以及SOCS1或可作為結核病診斷的新型生物標記分子。綜上所述,TLR2/NF-κB/mi R-155/SOCS1信號參與了ESAT-6介導的巨噬細胞凋亡過程,mi R-155在ESAT-6介導的巨噬細胞免疫反應中發(fā)揮重要作用,這可能揭示了結核早期分泌抗原ESAT-6在宿主免疫調(diào)節(jié)作用中的新機制。同時,本研究提示TLR2/NF-κB/mi R-155/SOCS1或可作為宿主免疫調(diào)節(jié)治療的重要靶標,為結核治療研究增添了新的內(nèi)容;此外,人群研究提示TLR2,BIC,mi R-155及SOCS1或可作為活動型結核及潛伏型結核診斷的重要指標,為結核病的診斷可能提供了新的思路。
【關鍵詞】：凋亡 早期分泌抗原6 微小RNA-155 核轉錄因子-κB 細胞因子信號抑制因子-1 Toll樣受體-2 結核病
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R52
【目錄】：

• 英文縮寫一覽表4-7
• 英文摘要7-12
• 中文摘要12-15
• 第一章 前言15-23
• 1.1 選題緣由15-16
• 1.2 研究背景16-22
• 1.3 研究意義22-23
• 第二章 miRNA-155靶向作用SOCS1基因調(diào)控結核早期分泌抗原ESAT-6 介導的巨噬細胞凋亡23-53
• 2.1 材料與方法24-40
• 2.2 結果40-50
• 2.3 討論50-53
• 第三章 miRNA-155及SOCS1的表達在活動型結核及潛伏型結核診斷中的作用53-65
• 3.1 材料與方法54-59
• 3.2 結果59-62
• 3.3 討論62-65
• 全文總結65-66
• 本研究的創(chuàng)新之處66-67
• 參考文獻67-79
• 文獻綜述 抗結核病治療研究進展79-105
• 參考文獻93-105
• 附錄105-107
• 攻讀學位期間的研究成果107-108
• 致謝108

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