本文關(guān)鍵詞：1α,25二羥維生素D3對肺動脈高壓的作用及microRNA機制研究

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【摘要】：第一部分1α,25二羥維生素D3通過micro RNA-27b靶向維生素D受體抑制人肺成纖維細胞的分化目的:1.探討1,25(OH)2D3對于TGF-β1誘導(dǎo)人胚肺成纖維細胞分化的作用。2.探討mi R-27b對于人肺成纖維細胞分化的調(diào)節(jié)作用。3.進一步研究mi R-27b的靶基因和作用機制。方法:1.細胞藥物干預(yù):細胞分為對照組(Control group)、TGF-β1模型組(TGF-β1 group)、TGF-β1模型加1,25(OH)2D3干預(yù)組(TGF-β1+VD group)。細胞培養(yǎng)皿中各組細胞密度生長至70-80%匯合時,給予無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)血清饑餓24h,加入相應(yīng)藥物或?qū)φ瘴锖笥煤?%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h。各組加入藥物或?qū)φ瘴锶缦?TGF-β1+VD組培養(yǎng)基中加入一定量的濃度為2 ug/ml人重組TGF-β1蛋白,使其終濃度為10 ng/ml,同時加入濃度為20 umol/L的1,25(OH)2D3溶液,使其終濃度為100 n M;TGF-β1組培養(yǎng)基中加入一定量的濃度為2 ug/ml人重組TGF-β1蛋白,使其終濃度為10 ng/ml,同時加入相應(yīng)量的95%乙醇對照;Control組給予相應(yīng)量的PBS溶液和95%乙醇對照。2.提取細胞總RNA和總蛋白,通過實時定量RT-PCR和Western blot以及免疫熒光方法檢測細胞中α-SMA和VDR m RNA和蛋白的表達。3.提取細胞micro RNA,通過實時定量RT-PCR檢測細胞中mi R-27b的表達。4.為明確mi R-27b是否調(diào)節(jié)人肺成纖維細胞的分化,在MRC5細胞中轉(zhuǎn)染scramble、mi R-27b mimic或mi R-27b inhibitor并且分析α-SMA的表達水平;為進一步研究mi R-27b是否調(diào)節(jié)VDR基因的表達,在MRC5細胞中轉(zhuǎn)染scramble、mi R-27bmimic或mi R-27b inhibitor并且分析VDR的表達水平。5.為明確mi R-27b是否直接靶向VDR 3’UTR,在熒光素酶報告基因載體構(gòu)建過程中引入野生型和突變型VDR 3’UTR。這些載體與scramble,mi R-27b mimic或mi R-27b mimic+inhibitor共轉(zhuǎn)染293A細胞,然后檢測熒光素酶的活性。結(jié)果:1.1,25(OH)2D3對于TGF-β1誘導(dǎo)人肺成纖維細胞分化的作用以及VDR表達的影響:在MRC5細胞中,TGF-β1能顯著提高α-SMA m RNA和蛋白表達水平;而1,25(OH)2D3則能有效抑制上述作用。TGF-β1能顯著下調(diào)MRC5細胞VDR蛋白的表達,加入1,25(OH)2D3后VDR蛋白的表達上升,然而Control組、TGF-β1模型組、TGF-β1+VD組之間VDR m RNA水平?jīng)]有顯著差異。2.1,25(OH)2D3對TGF-β1誘導(dǎo)人肺成纖維細胞mi R-27b表達的影響:TGF-β1能顯著上調(diào)MRC5細胞mi R-27b的表達,加入1,25(OH)2D3后能有效減少mi R-27b的表達。3.mi R-27b調(diào)節(jié)人肺成纖維細胞的分化和VDR蛋白的表達:mi R-27b的過表達顯著上調(diào)α-SMA的m RNA和蛋白表達水平,而mi R-27b抑制劑明顯下調(diào)α-SMA的m RNA和蛋白表達水平。而且,mi R-27b抑制劑減少TGF-β1誘導(dǎo)的肺成纖維細胞α-SMA m RNA和蛋白表達水平;mi R-27b過表達增加1,25(OH)2D3處理的肺成纖維細胞α-SMA m RNA和蛋白表達水平。mi R-27b的過表達顯著下調(diào)VDR蛋白表達水平,而mi R-27b抑制劑明顯上調(diào)VDR蛋白表達水平。然而,mi R-27b的過表達或mi R-27b抑制劑并不影響VDR的轉(zhuǎn)錄水平。而且,mi R-27b抑制劑具有抑制TGF-β1下調(diào)肺成纖維細胞VDR蛋白表達的作用;mi R-27過表達降低1,25(OH)2D3處理的肺成纖維細胞VDR的蛋白表達水平。在這種情況下同樣地,mi R-27b抑制劑或mi R-27b過表達并不影響VDR的轉(zhuǎn)錄水平。4.mi R-27b對VDR 3’UTR的靶向作用:mi R-27b mimic能顯著降低熒光素酶活性,加入mi R-27b inhibitor后,熒光素酶活性增加。然而,將VDR 3’UTR保守序列進行突變后,mi R-27b mimic或mi R-27b inhibitor對熒光素酶活性作用均消失。結(jié)論:1.濃度為100n M的1,25(OH)2D3能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的人肺成纖維細胞分化,并且下調(diào)mi R-27b的表達。2.mi R-27b過表達降低人肺成纖維細胞VDR的蛋白表達并且增加α-SMA的表達,促進人肺成纖維細胞的分化,而抑制mi R-27b的表達則顯示出相反作用。3.1,25(OH)2D3通過mi R-27b直接靶向VDR 3’UTR,從而抑制TGF-β1誘導(dǎo)的人肺成纖維細胞的分化。第二部分1α,25二羥維生素D3抑制野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓作用目的:1.利用皮下注射野百合堿誘導(dǎo)大鼠肺動脈高壓模型,觀察1,25(OH)2D3對肺血管病變的影響。2.1,25(OH)2D3早期干預(yù)對野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠肺組織中TGF-β1表達的影響。方法:1.實驗動物及分組:32只SPF級雄性Sprague-Dawley大鼠,隨機分為4組:對照組(Control group)、1,25(OH)2D3組(VD group)、野百合堿模型組(MCT group)、野百合堿模型加1,25(OH)2D3干預(yù)組(MCT+VD group),每組8只。2.MCT誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠模型建立及1,25(OH)2D3干預(yù):MCT組、MCT+VD組每只大鼠給予野百合堿60mg/kg體重,背部皮下一次性注射;Control組、VD組僅給予相應(yīng)生理鹽水皮下注射。VD組、MCT+VD組在生理鹽水或野百合堿注射的當日開始給予1,25(OH)2D3,按0.5ug/100g體重進行腹腔注射,每周兩次,共3周;Control組、MCT組給予相應(yīng)生理鹽水腹腔注射。3.第22天行肺動脈平均壓測定;并分離出大鼠心臟,沿室間隔仔細分離右心室和左心室+室間隔,計算右心室肥厚指數(shù)。4.肺組織標本切片、HE染色,光鏡下觀察肺小動脈結(jié)構(gòu),并計算中膜厚度占管腔的比例(WT%),血管壁中層橫截面積占血管總橫截面積百分比(MA%)。5.通過實時定量RT-PCR和Western blot方法檢測肺組織中TGF-β1 m RNA和蛋白的表達。結(jié)果:1.1,25(OH)2D3對野百合堿誘導(dǎo)大鼠的肺動脈平均壓、右心室肥厚指數(shù)及肺血管形態(tài)學(xué)指標的作用:野百合堿皮下注射3周后MCT組大鼠肺動脈平均壓(m PAP)、右心室肥厚指數(shù)(RVHI)、WT%、WA%均較正常對照組明顯增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。1,25(OH)2D3干預(yù)后,MCT+VD組大鼠m PAP、RVHI、WT%、WA%均低于MCT組,差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義。2.1,25(OH)2D3對野百合堿誘導(dǎo)大鼠的肺小動脈形態(tài)學(xué)的作用:大鼠肺組織切片HE染色的結(jié)果顯示Control組、VD組大鼠肺組織光鏡下可見肺動脈管壁較薄,管腔正常,血管周圍無炎癥細胞浸潤。MCT組大鼠肺動脈管壁明顯增厚,管腔顯著狹窄,血管周圍炎癥細胞浸潤明顯。而MCT+VD組肺動脈結(jié)構(gòu)清晰,管壁無明顯增厚,肺動脈周圍炎癥細胞浸潤少。3.1,25(OH)2D3對野百合堿誘導(dǎo)大鼠的肺組織中TGF-β1表達的影響:野百合堿皮下注射3周后MCT組大鼠肺組織中TGF-β1蛋白表達較對照組明顯增高,1,25(OH)2D3干預(yù)后,MCT+VD組大鼠TGF-β1蛋白表達量顯著低于MCT組。然而Control組、MCT模型組、MCT+VD組之間TGF-β1 m RNA水平?jīng)]有顯著差結(jié)論：1.一次性給予大鼠皮下注射野百合堿(60mg/kg)3周后可成功建立大鼠肺動脈高壓模型,出現(xiàn)肺動脈壓力增加、肺血管重塑和炎癥。2.1,25(OH)2D3早期干預(yù)可延緩野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠肺動脈平均壓的升高,改善肺血流動力學(xué)、肺血管重塑和右室肥厚。3.1,25(OH)2D3早期干預(yù)可降低MCT大鼠肺組織中的TGF-β1表達水平,從而減少肺血管重構(gòu)的發(fā)生,減緩肺動脈高壓的發(fā)展。第三部分1α,25二羥維生素D3抑制野百合堿誘導(dǎo)大鼠肺動脈高壓的micro RNA機制研究目的:1.觀察1,25(OH)2D3對野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠肺組織中α-SMA、VDR、COL1A1、OPN表達的影響。2.觀察1,25(OH)2D3對野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠肺組織中mi R-27b表達的影響。方法:1.MCT誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠模型建立及1,25(OH)2D3干預(yù)。2.第22天進行肺組織標本采集,冰凍切片,以及總RNA、總蛋白和micro RNA提取。3.通過實時定量RT-PCR和Western blot方法檢測大鼠肺組織中α-SMA、VDR、COL1A1、OPN m RNA和蛋白的表達。4.通過實時定量RT-PCR檢測大鼠肺組織中mi R-27b的表達。結(jié)果:1.1,25(OH)2D3對野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠肺組織中α-SMA、COL1A1、OPN表達的影響:野百合堿皮下注射3周后,MCT組大鼠肺組織中α-SMA、COL1A1、OPN m RNA和蛋白表達較對照組明顯增高,而1,25(OH)2D3能有效抑制上述作用。2.1,25(OH)2D3對野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠肺組織中VDR表達的影響:野百\合堿皮下注射3周后MCT組大鼠肺組織中VDR蛋白表達較對照組明顯降低,1,25(OH)2D3干預(yù)后,MCT+VD組大鼠VDR蛋白表達量顯著高于MCT組,然而Control組、MCT模型組、MCT+VD組之間VDR m RNA水平?jīng)]有顯著差異。3.1,25(OH)2D3對野百合堿誘導(dǎo)大鼠的肺組織中mi R-27b表達的作用:與對照組相比,MCT組大鼠肺組織中mi R-27b的表達明顯增高。1,25(OH)2D3干預(yù)后,MCT+VD組大鼠肺組織中mi R-27b的表達明顯低于MCT組。結(jié)論:1.野百合堿(60mg/kg)皮下注射3周后可誘導(dǎo)大鼠發(fā)生明顯的肺血管重塑和炎癥,大鼠肺組織肌成纖維細胞的生成增多,肺組織中α-SMA、COL1A1和OPN的表達上調(diào)。2.1,25(OH)2D3通過作用于VDR抑制野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺組織中α-SMA、COL1A1和OPN的表達。3.mi R-27b可能在野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺組織α-SMA蛋白表達中起調(diào)節(jié)作用。
【關(guān)鍵詞】：1 25(OH)2D3 α-平滑肌肌動蛋白 維生素D受體 mi R-27b 成纖維細胞 1 25(OH)2D3 野百合堿 肺動脈高壓 肺動脈平均壓 右心室肥厚指數(shù) α-平滑肌肌動蛋白 維生素D受體 膠原蛋白 骨橋蛋白 mi R-27b
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R544.1
【目錄】：

• 中文摘要6-12
• 英文摘要12-19
• 常用縮寫詞中英文對照表19-20
• 前言20-21
• 第一部分 1α, 25二羥維生素D3通過micro RNA-27b靶向維生素D受體抑制人肺成纖維細胞的分化21-57
• 1 材料與方法22-41
• 1.1 主要儀器22-23
• 1.2 主要試劑及配制23-27
• 1.3 實驗方法27-40
• 1.4 統(tǒng)計分析40-41
• 2 結(jié)果41-54
• 2.1 1,25(OH)2D3抑制TGF-β1 誘導(dǎo)人肺成纖維細胞的分化41-44
• 2.2 1,25(OH)2D3下調(diào)TGF-β1 誘導(dǎo)人肺成纖維細胞mi R-27b的表達44
• 2.3 mi R-27b調(diào)節(jié)人肺成纖維細胞的分化和VDR蛋白的表達44-52
• 2.4 mi R-27b直接靶向VDR 3’UTR52-54
• 3 討論54-56
• 4 結(jié)論56-57
• 第二部分 1α, 25二羥維生素D3抑制野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓作用57-77
• 1 材料與方法59-68
• 1.1 主要儀器59-60
• 1.2 主要試劑及配制60-63
• 1.3 實驗方法63-66
• 1.4 統(tǒng)計分析66-68
• 2 結(jié)果68-73
• 2.1 1,25(OH)2D3對野百合堿誘導(dǎo)大鼠的肺動脈平均壓、右心室肥厚指數(shù)及肺血管形態(tài)學(xué)指標的作用68-70
• 2.2 1,25(OH)2D3對野百合堿誘導(dǎo)大鼠的肺小動脈形態(tài)學(xué)的作用70-71
• 2.3 1,25(OH)2D3對野百合堿誘導(dǎo)大鼠的肺組織中TGF-β1 表達的影響71-73
• 3 討論73-76
• 4 結(jié)論76-77
• 第三部分 1α, 25二羥維生素D3抑制野百合堿誘導(dǎo)大鼠肺動脈高壓的micro RNA機制研究77-94
• 1 材料與方法78-84
• 1.1 主要儀器78
• 1.2 主要試劑及配制78-80
• 1.3 實驗方法80-83
• 1.4 統(tǒng)計分析83-84
• 2 結(jié)果84-89
• 2.1 1,25(OH)2D3對野百合堿誘導(dǎo)大鼠的肺組織中 α-SMA、COL1A1和OPN m RNA以及蛋白表達的作用84-87
• 2.2 1,25(OH)2D3對野百合堿誘導(dǎo)大鼠的肺組織中VDR m RNA和蛋白表達的作用87-88
• 2.3 1,25(OH)2D3對野百合堿誘導(dǎo)大鼠的肺組織中mi R-27b表達的作用88-89
• 3 討論89-93
• 4 結(jié)論93-94
• 參考文獻94-117
• 綜述117-143
• 參考文獻131-143
• 致謝143-144
• 在學(xué)期間承擔/參與的科研課題與研究成果144-145
• 個人簡歷145

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