本文關(guān)鍵詞：TLR4上調(diào)ACAT1表達(dá)促進(jìn)平滑肌源性泡沫細(xì)胞形成的機(jī)制研究

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【摘要】：背景和目的:動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是一種動(dòng)脈血管進(jìn)行性堵塞的慢性疾病。AS作為多種心腦血管疾病發(fā)生的病理基礎(chǔ),目前其已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)引起死亡的主要原因之一。世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)顯示在2008年全球有將近1730萬(wàn)患者死于心血管疾病,而到2030年,因心血管疾病死亡的人數(shù)將增加至2330萬(wàn)。因此,積極探討AS發(fā)生與發(fā)展的具體機(jī)制對(duì)AS相關(guān)性疾病的防治具有重要的指導(dǎo)意義。泡沫細(xì)胞的形成是AS病變發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中至關(guān)重要的病理事件。AS病變過(guò)程中泡沫細(xì)胞主要來(lái)源于巨噬細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cell,VSMC)。酰基輔酶A:膽固醇�；D(zhuǎn)移酶-1(Acyl-coenzyme A:cholesterol acyltransferase 1,ACAT1)是細(xì)胞內(nèi)一種可將游離膽固醇轉(zhuǎn)變成膽固醇酯的酶,其在AS病變中泡沫細(xì)胞的形成過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。ACAT1在人體內(nèi)表達(dá)比較廣泛,例如其在巨噬細(xì)胞和VSMC的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上均有表達(dá)。目前關(guān)于ACAT1參與巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成的機(jī)制研究有很多,其中一個(gè)被廣泛接受的機(jī)制是炎癥反應(yīng)通過(guò)上調(diào)ACAT1的表達(dá)促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚積,最終導(dǎo)致泡沫細(xì)胞的形成。然而,相比巨噬細(xì)胞而言,目前關(guān)于平滑肌源性泡沫細(xì)胞形成的具體機(jī)制研究很少,尤其是ACAT1是否參與了平滑肌源性泡沫細(xì)胞的形成過(guò)程仍不清楚。AS病變的發(fā)生與發(fā)展涉及多個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程,受多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié),其中慢性炎癥反應(yīng)是AS病變發(fā)生與發(fā)展的一大病理基礎(chǔ)。Toll樣受體4(Toll like receptor 4,TLR4)是啟動(dòng)免疫和炎性反應(yīng)的重要膜受體,其在體內(nèi)引發(fā)炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用,有研究顯示其參與AS病變的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程。例如最近有研究發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)可通過(guò)影響TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)抑制血小板衍生的生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的VSMC增殖與遷移。此外,也有研究發(fā)現(xiàn)肺炎衣原體可以通過(guò)干擾PPARγ激活上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ACAT1表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)低密度脂蛋白引起的巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成。而需要注意的是肺炎衣原體的細(xì)胞膜中主要成分是TLR4的特異性配體脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS),其與TLR4結(jié)合后可以觸發(fā)炎癥反應(yīng)的激活,誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子表達(dá),如白介素-1(interleukin-1)、il-6和腫瘤壞死因子α(tumournecrosisfactorα,tnf-α)。以上研究結(jié)果提示了我們pparγ、tlr4和acat1在泡沫細(xì)胞形成中的重要作用,因此,基于以上研究我們假設(shè)pparγ可以通過(guò)干擾tlr4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)進(jìn)而下調(diào)acat1的表達(dá),最終抑制平滑肌源性泡沫細(xì)胞的形成。材料與方法:本研究分為在體實(shí)驗(yàn)和離體實(shí)驗(yàn)兩大部分。c57bl/6j背景野生型(wt)小鼠、apoe基因敲除(apoe-/-)小鼠、tlr4基因敲除(tlr4-/-)小鼠和acat1基因敲除(acat1-/-)小鼠被應(yīng)用于在體實(shí)驗(yàn);原代培養(yǎng)的vsmc來(lái)源于c57bl/6j背景wt小鼠、acat1-/-小鼠和tlr4-/-小鼠,被應(yīng)用于離體實(shí)驗(yàn)。1.應(yīng)采用蘇木精-伊紅(he)染色法確定小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成情況;2.應(yīng)用油紅o染色法檢測(cè)離體vsmc泡沫細(xì)胞形成情況;3.應(yīng)用酶法測(cè)定法檢測(cè)離體vsmc內(nèi)總膽固醇含量;4.應(yīng)用含有acat1cdna的腺病毒載體轉(zhuǎn)染離體vsmc上調(diào)細(xì)胞中acat1的表達(dá);5.應(yīng)用tlr4配體lps和tlr4抑制劑eritoran分別上調(diào)和下調(diào)離體vsmc中tlr4表達(dá);6.應(yīng)用髓樣分化因子88(myeloiddifferentiationfactor88,myd88)和核因子κb(nuclearfactor-kappab,nf-κb)的sirna化學(xué)片段轉(zhuǎn)染離體vsmc,下調(diào)細(xì)胞內(nèi)myd88和nf-κb表達(dá);7.應(yīng)用過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisomeproliferator-activatedreceptorγ,pparγ)配體羅格列酮(rosiglitazone,rsg)和pparγ抑制劑gw9662分別上調(diào)和下調(diào)離體vsmc中pparγ表達(dá);8.應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorbentassay,elisa)檢測(cè)在體及離體il-1β、il-6和tnf-α表達(dá);9.應(yīng)用免疫印跡(westernblot)檢測(cè)tlr4、myd88、nf-κbp65、磷酸化的iκbα(phosphorylatediκbα,p-iκbα)和acat1的表達(dá);此外,免疫熒光技術(shù)也被用于檢測(cè)離體vsmc中acat1的表達(dá);結(jié)果:1.acat1在as斑塊形成和oxldl誘導(dǎo)的平滑肌源性泡沫細(xì)胞形成中的作用⑴.高脂(highfat,hf)飲食顯著上調(diào)apoe-/-小鼠主動(dòng)脈acat1的表達(dá),并導(dǎo)致apoe-/-小鼠主動(dòng)脈形成明顯的as斑塊。而對(duì)于apoe和acat1雙基因敲(apoe/acat1-/-)小鼠,hf飲食并不能有效誘導(dǎo)其as斑塊的形成。⑵.oxldl呈時(shí)間依賴性的上調(diào)離體培養(yǎng)vsmc中acat1的表達(dá),在第48h達(dá)到頂峰。此外,oxldl刺激導(dǎo)致體外培養(yǎng)vsmc發(fā)生泡沫化。acat1高表達(dá)進(jìn)一步促進(jìn)oxldl引起的vsmc中脂質(zhì)堆積,而acat1缺乏顯著抑制oxldl引起的vsmc中脂質(zhì)堆積。2.tlr4在as斑塊形成和oxldl誘導(dǎo)的平滑肌源性泡沫細(xì)胞形成中的作用⑴.hf飲食顯著上調(diào)apoe-/-小鼠主動(dòng)脈中tlr4及炎性細(xì)胞因子的表達(dá),包括il-1β、il-6和tnf-α,同時(shí)促進(jìn)apoe-/-小鼠as斑塊形成。而對(duì)于apoe/tlr4-/-小鼠,hf飲食不能誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)和as斑塊形成。⑵.oxldl呈時(shí)間依賴性的上調(diào)離體培養(yǎng)vsmc中tlr4的表達(dá),最大效應(yīng)在24h時(shí)出現(xiàn),且同時(shí)應(yīng)用oxldl與lps可進(jìn)一步增加vsmc中tlr4的表達(dá)。此外,oxldl顯著促進(jìn)炎性細(xì)胞因子包括il-1β、il-6和tnf-α的表達(dá),且lps可進(jìn)一步增強(qiáng)以上效應(yīng)。在wt型vsmc中應(yīng)用lps激活tlr4可進(jìn)一步增加oxldl引起的脂質(zhì)蓄積。而對(duì)于tlr4-/-型vsmc,oxldl與lps并不能顯著增加vsmc中的脂質(zhì)蓄積,且二者也不能有效上調(diào)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。3.tlr4與acat1在調(diào)節(jié)as斑塊形成和平滑肌源性泡沫細(xì)胞形成中的關(guān)系⑴.hf飲食可顯著上調(diào)apoe-/-小鼠主動(dòng)脈中acat1的表達(dá),而對(duì)于apoe/tlr4-/-小鼠,hf飲食并不能有效地上調(diào)其主動(dòng)脈中acat1的表達(dá)。⑵.在wt型vsmc中激活或抑制tlr4可分別促進(jìn)和抑制由oxldl引起的acat1表達(dá)上調(diào)。而對(duì)于tlr4-/-型vsmc,oxldl和lps刺激均不能有效上調(diào)acat1表達(dá)。⑶.在wt型vsmc中激活和抑制tlr4表達(dá)可分別促進(jìn)和阻礙oxldl誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞形成。然而,acat1缺陷會(huì)損害以上tlr4效應(yīng);對(duì)于acat1缺陷的vsmc,tlr4激活或抑制對(duì)泡沫細(xì)胞的形成沒(méi)有明顯的影響。而acat1缺陷并不影響vsmc中tlr4的表達(dá)。⑷.oxldl單獨(dú)應(yīng)用或聯(lián)合lps刺激可顯著上調(diào)wt型vsmc中myd88、nf-κbp65和p-iκbα的表達(dá)水平。而對(duì)于tlr4-/-型vsmc,oxldl和/或lps刺激并不能有效地誘導(dǎo)myd88、nf-κbp65和p-iκbα的表達(dá)。myd88缺陷損害oxldl和/或lps誘導(dǎo)的nf-κbp65、p-iκbα和acat1的表達(dá)。nf-κbp65缺陷也損害oxldl和/或lps誘導(dǎo)的acat1的表達(dá)。4.pparγ在as斑塊形成和oxldl誘導(dǎo)的平滑肌源性泡沫細(xì)胞形成中的作用⑴.激活PPARγ可顯著抑制HF飲食喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠AS斑塊的形成。此外,ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈中由HF飲食誘導(dǎo)的TLR4、炎性細(xì)胞因子和ACAT1的表達(dá)也被PPARγ激活所顯著抑制。與此相反,激活PPARγ對(duì)Apo E/TLR4-/-小鼠AS斑塊的形成及炎性細(xì)胞因子和ACAT1表達(dá)無(wú)明顯影響。此外,TLR4缺陷并不影響體內(nèi)PPARγ的表達(dá)。⑵.在WT型VSMC中激活或抑制PPARγ可分別抑制或促進(jìn)由ox LDL引起的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚積。而在TLR4-/-型VSMC中,無(wú)論是激活PPARγ還是抑制PPARγ,對(duì)VSMC泡沫化無(wú)明顯影響。此外,PPARγ活化和抑制可分別抑制和促進(jìn)WT型VSMC中TLR4、炎性細(xì)胞因子、MyD88、NF-κB p65、p-IκBα和ACAT1的表達(dá)水平。而對(duì)于TLR4-/-型VSMC,PPARγ活化和抑制并不能有效地影響TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和ACAT1的表達(dá)。同時(shí),和體內(nèi)PPARγ的表達(dá)一樣,TLR4缺陷并不影響PPARγ的表達(dá)。結(jié)論:本研究提供的證據(jù)顯示在AS病變過(guò)程中ox LDL刺激可以通過(guò)激活TLR4/MyD88/NF-κB炎癥信號(hào)通路上調(diào)VSMC中ACAT1的表達(dá),并最終促進(jìn)平滑肌源性泡沫細(xì)胞的形成。此外,PPARγ可以通過(guò)抑制上述炎癥信號(hào)通路抑制ox LDL誘導(dǎo)的平滑肌源性泡沫細(xì)胞的形成。我們的研究闡明了PPARγ、TLR4和ACAT1在平滑肌源性泡沫細(xì)胞形成過(guò)程中的病理作用,為AS防治提供了潛在的干預(yù)靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：Toll樣受體4 �；o酶A:膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶-1 過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ 血管平滑肌細(xì)胞 泡沫細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R543.5
【目錄】：

• 英文縮寫一覽表5-7
• Abstract7-12
• 摘要12-16
• 第一章 前言16-20
• 第二章 ACAT1在平滑肌源性泡沫細(xì)胞形成中發(fā)揮重要作用20-43
• 2.1 在體檢測(cè)ACAT1在AS斑塊形成中的作用20-30
• 2.1.1 材料與方法20-26
• 2.1.2 結(jié)果26-29
• 2.1.3 討論29-30
• 2.2 離體檢測(cè)ACAT1在平滑肌源性泡沫細(xì)胞形成中的作用30-43
• 2.2.1 材料與方法31-36
• 2.2.2 結(jié)果36-41
• 2.2.3 討論41-43
• 第三章 TLR4在平滑肌源性泡沫細(xì)胞形成中發(fā)揮重要作用43-60
• 3.1 在體檢測(cè)TLR4在AS斑塊形成中的作用43-50
• 3.1.1 材料與方法43-46
• 3.1.2 結(jié)果46-49
• 3.1.3 討論49-50
• 3.2 離體檢測(cè)TLR4在平滑肌源性泡沫細(xì)胞形成中的作用50-60
• 3.2.1 材料與方法50-52
• 3.2.2 結(jié)果52-58
• 3.2.3 討論58-60
• 第四章 TLR4通過(guò)上調(diào)ACAT1的表達(dá)促進(jìn)平滑肌源性泡沫細(xì)胞的形成60-67
• 4.1 材料與方法60-62
• 4.2 結(jié)果62-65
• 4.3 討論65-67
• 第五章 MyD88/ NF-κB炎癥信號(hào)通路介導(dǎo)了TLR4對(duì)ACAT1的上調(diào)作用67-78
• 5.1 材料與方法67-71
• 5.2 結(jié)果71-76
• 5.3 討論76-78
• 第六章 PPARγ 通過(guò)干擾TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及ACAT1表達(dá)抑制平滑肌源性泡沫細(xì)胞形成78-98
• 6.1 在體檢測(cè)PPARγ 在AS斑塊形成中的作用78-86
• 6.1.1 材料與方法78-80
• 6.1.2 結(jié)果80-84
• 6.1.3 討論84-86
• 6.2 離體檢測(cè)PPARγ 在平滑肌源性泡沫細(xì)胞形成中的作用86-98
• 6.2.1 材料與方法86-88
• 6.2.2 結(jié)果88-95
• 6.2.3 討論95-98
• 全文結(jié)論98-99
• 參考文獻(xiàn)99-104
• 文獻(xiàn)綜述 TLR4及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用研究進(jìn)展104-124
• 參考文獻(xiàn)116-124
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果124-126
• 致謝126

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

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本文編號(hào)：907691