本文關(guān)鍵詞：MicroRNAs在肝癌細(xì)胞復(fù)發(fā)、EMT轉(zhuǎn)換及干細(xì)胞特性維持中的作用及機制研究

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【摘要】：研究背景肝癌是目前發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤之一,根據(jù)1999年上海市腫瘤流行病學(xué)調(diào)查,肝癌的發(fā)病率在男性40.0/10萬,在女性為14.8/10萬,分別列惡性腫瘤發(fā)病率第3位和第5位。據(jù)1998年統(tǒng)計,全球肝癌死亡率為10.3/10萬,在全球男性中占第7位,女性中占第9位。在我國,根據(jù)1997年報道27個省、市、自治區(qū)1990-1992年抽樣地區(qū)分析,肝癌死亡率為20.37/10萬(男性29.01/10萬,女性11.21/10萬),占惡性腫瘤死亡率的第2位,在男性中僅次于胃癌,在女性則次于胃癌和食管癌居第3位。原發(fā)性肝癌起病隱匿,在早期(亞臨床肝癌)并無明顯的癥狀和體征,若具有典型的癥狀和體征,則已為中晚期,治療效果較差。晚期肝癌的治療仍以放、化療為基礎(chǔ)的綜合治療為主,在肝癌的治療中,復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和超級耐藥始終是非常棘手的問題。肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是一個多步驟、多環(huán)節(jié)的過程,其分子機制涉及癌基因、抑癌基因、轉(zhuǎn)移相關(guān)基因、生長因子及其受體、細(xì)胞外基質(zhì)、腫瘤血管、機體免疫等多個環(huán)節(jié)。近年來,人們在乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、食道癌模型中發(fā)現(xiàn)了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)現(xiàn)象,說明EMT也是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要機制之一,并與腫瘤干細(xì)胞形成和耐藥性相關(guān)。在原發(fā)性肝癌的細(xì)胞及動物模型、臨床研究中同樣發(fā)現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象,且EMT的發(fā)生與肝癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和化療耐藥相關(guān)。Epithelial-to-mesenchymal transition(EMT)是一個上皮細(xì)胞失去上皮特性同時獲得間質(zhì)特性,并且具有運動能力的生物學(xué)過程,目前認(rèn)為EMT與腫瘤轉(zhuǎn)移初始階段有關(guān)。Gregory等的研究提示micro RNA-200的家族成員(micro RNA-200a/b/c,micro RNA-141和micro RNA-492)及micro RNA-205的表達水平在TGF-β誘導(dǎo)的EMT過程中顯著降低,提示micro RNA可能調(diào)控EMT現(xiàn)象。后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn),micro RNA-200家族及micro RNA-205可以起始EMT轉(zhuǎn)換過程,提示micro RNA在EMT的調(diào)控中起重要作用。而最新的研究表明EMT轉(zhuǎn)換同樣可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對化療或靶向藥物的耐藥,Ceppi等研究就發(fā)現(xiàn)對西妥昔單抗和順鉑耐藥的肺癌細(xì)胞中,間質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的蛋白表達量顯著增高,EMT現(xiàn)象特征十分明顯,而micro RNA-200c的過表達則可以部分恢復(fù)細(xì)胞對順鉑的敏感并減低其侵襲能力。微小RNA(microRNA,miRNA)為一類高度保守的、長度通常為20-24個核苷酸的非編碼單鏈小RNA,近年來的研究表明,micro RNA和肝癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究基于60例臨床肝癌組織標(biāo)本(30例復(fù)發(fā),30例原發(fā)樣本)的micro RNA表達譜分析,探究與EMT,復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)的micro RNAs功能,特別是mi RNA-489在肝癌的EMT轉(zhuǎn)換和復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及mi RNA-205在肝癌干細(xì)胞特性的維持作用,進一步確定其關(guān)鍵功能靶標(biāo)和下游信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò),深入了解HCC的EMT轉(zhuǎn)換和干細(xì)胞形成和維持的分子機制,為肝癌提供新的預(yù)后標(biāo)志物和基于mi RNA的肝癌治療策略具有至關(guān)重要的臨床意義。第一部分微小RNA(micro RNA)在肝癌復(fù)發(fā)和細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)中的作用[目的]本部分研究旨在進一步采用micro RNA表達譜分析和實時定量熒光PCR分析復(fù)發(fā)與非復(fù)發(fā)的肝癌臨床組織及相關(guān)細(xì)胞株,挑選和鑒定可能與原發(fā)性肝癌復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移相關(guān)micro RNAs。[方法]1.收集臨床上復(fù)發(fā)和非復(fù)發(fā)的肝癌組織樣本,結(jié)合一系列肝癌細(xì)胞系,利用micro RNA表達譜芯片技術(shù)(Gene Chip micro RNA 2.0 Array,affymetrix),檢測相關(guān)樣品的micro RNAs表達圖譜,并比較其差異。2.為了進一步驗證芯片結(jié)果的可靠性,利用mi R-q RT-PCR定量PCR試劑盒(Applied Biosystem),以U6作為內(nèi)參,對差異表達的micro RNA進行實時定量PCR驗證。3.mi RNA-489在肝癌復(fù)發(fā)組織中差異性很高,我們推測mi RNA-489可能參與肝癌的復(fù)發(fā);使用生物信息軟件,我們尋找mi RNA-489在基因組中的定位及靶點。4.mi RNA-205因表達差異及在干細(xì)胞特性維持中的作用,是我們重點研究的mi RNA之一,使用生物信息軟件,我們尋找mi RNA-205在基因組中的定位及靶點。[結(jié)果]1.Agilent human mi RNA芯片V12.0證實和親本肝癌細(xì)胞相比,復(fù)發(fā)的肝癌細(xì)胞有30個表達差異的mi RNA,其中mi RNA-489在復(fù)發(fā)肝癌細(xì)胞中高表達,是原來肝癌細(xì)胞組織的12倍。2.RT-PCR驗證miRNA的表達,miRNA-489、miRNA-34a、miRNA-21和miRNA-7在復(fù)發(fā)肝癌細(xì)胞組織中高表達,上調(diào)12.3、5.2、3.1、2.2倍,而mi RNA-205、mi RNA-145、mi RNA-452、mi RNA-125a-3p等在復(fù)發(fā)細(xì)胞中低表達,分別下調(diào)16、14、7.1、6.5倍,結(jié)果和芯片結(jié)果一致,驗證了芯片結(jié)果。[結(jié)論]本研究證實mi R-489及mi R-205可能參與肝癌復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移,其機制可能涉及EMT轉(zhuǎn)換及干細(xì)胞特性的維持。第二部分mi RNA-489在肝癌細(xì)胞復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及EMT轉(zhuǎn)換中的可能機制[目的]本部分旨在闡明mi RNA-489參與肝癌細(xì)胞復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及EMT轉(zhuǎn)換中的可能機制。[方法]1.mi RNA-489在復(fù)發(fā)肝癌細(xì)胞株中高表達(為親本肝癌細(xì)胞株的12倍左右),我們推測mi RNA-489可能參與肝癌細(xì)胞復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移;使用生物信息軟件,結(jié)合micro RNA數(shù)據(jù)庫Miranda(www.microrna.org/microma/home.do),mi RBASE(www.mirbase.org)和Target Scan(http://www.targetscan.org/)及Pic Tar(http://pictar.bio.nyu.edu)等,我們尋找mi RNA-489潛在的靶點。2.micro RNA通過和靶基因的3’UTR段相結(jié)合而發(fā)揮調(diào)控作用,我們構(gòu)建了Smad3 3’UTR段的wild-type和mutant的載體。3.使用dual-luciferase熒光報告系統(tǒng),以證明在細(xì)胞內(nèi)mi RNA-489是否可以和Smad3結(jié)合。4.轉(zhuǎn)染mi RNA-489表達質(zhì)粒,在低表達mi RNA-489的肝癌細(xì)胞株中高表達mi RNA-489后,檢測相關(guān)細(xì)胞通路的蛋白的表達及EMT轉(zhuǎn)換。[結(jié)果]1.結(jié)合生物信息軟件,我們證實了Smad3是mi RNA-489下游作用靶點之一。2.成功構(gòu)建了Smad3 3’UTR段的wild-type和mutant的載體。3.發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)后,Smad3 3’UTR突變的(mutant)的質(zhì)粒因與mi RNA-489不能結(jié)合,其熒光強度高,而Smad3 3’UTR野生型的(wild-type)的質(zhì)粒因為能與mi RNA-489結(jié)合,導(dǎo)致其在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制受阻,其熒光強度減低了約60%,其熒光強度值之比具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4.在上皮型的肝癌細(xì)胞中,mi RNA-489低表達,而高表達mi RNA-489后,細(xì)胞向間質(zhì)型轉(zhuǎn)換。5.在間質(zhì)型肝癌細(xì)胞中,mi RNA-489高表達,而低表達mi RNA-489后,細(xì)胞向上皮型轉(zhuǎn)換。[結(jié)論]本研究證實在體外,mi RNA-489通過調(diào)節(jié)Smad3通路,參與調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)換,從而促進肝癌細(xì)胞的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。第三部分mi RNA-205在肝癌細(xì)胞干細(xì)胞特性維持中的作用和可能機制[目的]本部分旨在闡明mi RNA-205在維持肝癌干細(xì)胞特性中的作用及可能機制。[方法]1.mi RNA-205可能參與肝癌干細(xì)胞特性的維持;使用生物信息軟件,結(jié)合micro RNA數(shù)據(jù)庫Miranda(www.microrna.org/microma/home.do),mi RBASE(www.mirbase.org)和Target Scan(http://www.targetscan.org/)及Pic Tar(http://pictar.bio.nyu.edu)等,我們尋找mi RNA-205潛在的靶點。2.micro RNA通過和靶基因的3’UTR段相結(jié)合而發(fā)揮調(diào)控作用,我們構(gòu)建了PLCβ-1 3’UTR段的wild-type和mutant的載體。3.使用dual-luciferase熒光報告系統(tǒng),以證明在細(xì)胞內(nèi)miRNA-205是否可以和PLCβ-1結(jié)合。4.mi RNA-205結(jié)合PLCβ-1可以上調(diào)CD24+維持肝癌干細(xì)胞特性。[結(jié)果]1.結(jié)合生物信息軟件,我們證實了PLCβ-1是mi R-205下游作用靶點之一。2.成功構(gòu)建了PLCβ-1 3’UTR段的wild-type和mutant的載體。3.發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)后,PLCβ-1 3’UTR突變的(mutant)的質(zhì)粒因與micro RNA-205不能結(jié)合,其熒光強度高,而PLCβ-1 3’UTR野生型(wild-type)的質(zhì)粒因為能與micro RNA-205結(jié)合,導(dǎo)致其在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制受阻,其熒光強度減低了約40%,其熒光強度值之比具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4.在肝癌細(xì)胞中mi RNA-205低表達,而高表達mi RNA-205后,干細(xì)胞形成能力減弱。[結(jié)論]本研究證實mi R-205通過調(diào)節(jié)PLCβ-1及上調(diào)CD24+維持肝癌細(xì)胞干細(xì)胞特性。
【關(guān)鍵詞】：肝癌 復(fù)發(fā) mi R-489 mi R-205 EMT 肝癌 micro RNA mi RNA-489 Smad3 EMT 肝癌 micro RNA mi RNA-205 PLCβ-1 CD24+ 干細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 摘要9-15
• ABSTRACT15-22
• 第1章 前言22-33
• 1.1 microRNA簡介22-26
• 1.1.1 microRNA的發(fā)現(xiàn)23
• 1.1.2 microRNA的合成23-24
• 1.1.3 microRNA的功能24-26
• 1.2 microRNA與腫瘤26-30
• 1.2.1 Micro RNA 和腫瘤的發(fā)生發(fā)展26-27
• 1.2.2 Micro RNA 作為癌基因（oncogene）或抑癌基因（tumor suppressorgene）27-29
• 1.2.3 microRNA與肝癌29-30
• 1.3 microRNA研究現(xiàn)狀30-32
• 1.4 本文研究內(nèi)容32-33
• 第2章 微小RNA(micro RNA)在肝癌復(fù)發(fā)和細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換（EMT）中的作用33-45
• 2.1 實驗材料33-35
• 2.1.1 細(xì)胞和試劑33-34
• 2.1.2 溶液配制34-35
• 2.1.3 儀器設(shè)備及耗材35
• 2.2 實驗方法35-38
• 2.2.1 細(xì)胞凍存35
• 2.2.2 細(xì)胞復(fù)蘇35
• 2.2.3 細(xì)胞傳代及培養(yǎng)35-36
• 2.2.4 總 RNA 抽提和提純36
• 2.2.5 micro RNA 芯片篩選差異表達36
• 2.2.6 RT-PCR 驗證差異表達的 microRNA36-37
• 2.2.7 miRNA靶點預(yù)測37
• 2.2.8 micro RNA mimic 或抑制劑的轉(zhuǎn)染37
• 2.2.9 MTS37-38
• 2.2.10 Annexin V-PI檢測細(xì)胞凋亡38
• 2.2.11 Transwell實驗38
• 2.2.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計38
• 2.3 實驗結(jié)果38-43
• 2.3.1 總RNA提取質(zhì)量38-39
• 2.3.2 差異表達的miRNA39-41
• 2.3.3 Real—time PCR 驗證芯片結(jié)果41
• 2.3.4 microRNA 靶基因的預(yù)測41-43
• 2.3.5 miRNA-489在人類基因組中位置43
• 2.3.6 micro RNA-205 在基因組中位置43
• 2.4 討論43-44
• 2.5 本章小結(jié)44-45
• 第 3 章 Mi RNA-489 在調(diào)控肝癌復(fù)發(fā)和 EMT 轉(zhuǎn)換中的作用和機制45-60
• 3.1 實驗材料45
• 3.1.1 細(xì)胞和試劑45
• 3.1.2 溶液配制45
• 3.1.3 儀器設(shè)備和耗材45
• 3.2 實驗方法45-50
• 3.2.1miRNA靶點預(yù)測45
• 3.2.2 Smad3載體構(gòu)建45-48
• 3.2.3 Real-time 定量 PCR48-49
• 3.2.4 MTS 檢測細(xì)胞抑制率49
• 3.2.5 Western-Blot49-50
• 3.2.6 Transwell侵襲實驗50
• 3.3 實驗結(jié)果50-56
• 3.3.1 miRNA-489靶點預(yù)測50
• 3.3.2 驗證 mi RNA-489 下游靶點 Smad350-51
• 3.3.3 mi RNA-489 導(dǎo)致肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移及 EMT 轉(zhuǎn)換的機制51-54
• 3.3.4 EMT相關(guān)蛋白的檢測54-55
• 3.3.5 細(xì)胞功能改變55-56
• 3.4 討論56-59
• 3.5 本章小結(jié)59-60
• 第 4 章 mi RNA-205 與肝癌干細(xì)胞特性的維持60-69
• 4.1 實驗材料60-61
• 4.1.1 試劑和細(xì)胞60
• 4.1.2 儀器設(shè)備和耗材60-61
• 4.2 實驗方法61
• 4.2.1 組織及細(xì)胞培養(yǎng)61
• 4.2.2 Real-time 定量 PCR61
• 4.2.3 MTS 檢測細(xì)胞抑制率61
• 4.2.4 Western-blot61
• 4.3 結(jié)果61-66
• 4.3.1 miRNA-205下游靶點預(yù)測61-62
• 4.3.2 驗證miRNA-205下游靶點62-63
• 4.3.3 miRNA-205導(dǎo)致肝癌轉(zhuǎn)移的機制63-64
• 4.3.4 CD24+細(xì)胞群體64-65
• 4.3.5 miRNA-205和PLCβ1 的臨床意義65-66
• 4.4 討論66-67
• 4.5 本章小結(jié)67-69
• 第5章 結(jié)論和展望69-71
• 5.1 結(jié)論69-70
• 5.2 展望70-71
• 參考文獻71-75
• 致謝75-76
• 附錄76-77
• 綜述77-85
• 參考文獻82-85

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