本文關(guān)鍵詞：Twist促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞能量代謝重塑的作用及相關(guān)機(jī)制研究

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【摘要】：目的：研究Twist對乳腺癌細(xì)胞能量代謝重塑的作用,以及能量代謝重塑對乳腺癌細(xì)胞遷移能力及EMT的影響,并進(jìn)一步闡明其內(nèi)在的分子作用機(jī)制,旨在為靶向腫瘤代謝的乳腺癌治療策略提供新的理論基礎(chǔ)。方法：體外培養(yǎng)MCF10A-Twist和MCF10A-Vector細(xì)胞,經(jīng)常氧(21%02)和低氧(1%02)分別處理1 h、3 h、6 h、12 h后：采用葡萄糖測定試劑盒檢測葡萄糖的消耗率；采用乳酸測定試劑盒檢測乳酸的生成率；Mito-Tracker green探針法檢測線粒體質(zhì)量；透射電鏡法檢測線粒體的形態(tài)和數(shù)量。構(gòu)建Twist基因干擾慢病毒載體,并建立穩(wěn)定敲除Twist基因的MCF1 OA-Twist-sh-Twist細(xì)胞系和BT549-sh-Twist細(xì)胞系：檢測葡萄糖消耗率及乳酸生成率；Mito-Tracker green探針法檢測線粒體質(zhì)量。利用生物信息學(xué)手段對本課題組前期的MCF10A-Twist和MCF10A-Vector的mRNA芯片和蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,篩選出能量代謝相關(guān)的差異基因；挑選差異基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證；Western Blot檢測關(guān)鍵基因在常氧(21%02)及低氧(1%02)條件下的表達(dá)情況；Western Blot檢測敲除Twist基因后關(guān)鍵基因的表達(dá)變化情況。WesternBlot檢測關(guān)鍵基因在MCF10A和BT549中的表達(dá)情況；Western Blot檢測BT549經(jīng)低氧(1%02)處理6h后關(guān)鍵基因的變化情況；Western Blot檢測BT549在敲除Twist基因后關(guān)鍵基因的表達(dá)變化情況。P13K特異性抑制劑LY294002分別作用MCF10A-Twist和MCF10A-Vector及BT549后(50μmol/L LY294002作用6 h),檢測葡萄糖消耗率及乳酸生成率；采用Mito-Tracker green探針法檢測線粒體質(zhì)量；Western Blot檢測關(guān)鍵基因的表達(dá)變化情況。對MCF10A-Twist和BT549采用siRNA沉默mTOR基因后,檢測mTOR及下游代謝相關(guān)基因PKM2和LDHA的表達(dá)變化。在MCF10A-Vector中用siRNA沉默野生型p53基因,同時在MCF10A-Twist中過表達(dá)野生型p53基因,然后檢測細(xì)胞中p53和G6PD的表達(dá)情況。Western Blot檢測MCF10A (Twist不表達(dá)),MCF7(Twist低表達(dá))和BT549(Twist高表達(dá))細(xì)胞中p53和G6PD的表達(dá)情況。對BT549細(xì)胞用siRNA沉默內(nèi)源突變型p53基因后,檢測p53和G6PD的表達(dá)情況。在BT549細(xì)胞中過表達(dá)野生型p53基因后,檢測p53和G6PD的表達(dá)情況。Transwell實(shí)驗(yàn)分別檢測特異性抑制劑LY294002作用MCF10A-Twist和BT549后以及在MCF10A-Twist和BT549中過表達(dá)野生型p53后細(xì)胞遷移能力的變化情況,并采用Western Blot檢測細(xì)胞中EMT標(biāo)志物的表達(dá)變化情況。結(jié)果：在常氧或低氧條件下,MCF10A-Twist的葡萄糖消耗率和乳酸生成率均高于MCF10A-Vector,低氧處理增加了葡萄糖消耗率和乳酸生成率,且這種變化存在時間效應(yīng)關(guān)系。與MCF10A-Vector相比,MCF10A-Twist的線粒體質(zhì)量降低,且低氧處理進(jìn)一步降低了線粒體質(zhì)量,電鏡下可見線粒體腫脹和縱型嵴等異常的線粒體形態(tài)。MCF10A-Twist重新敲除Twist基因后,葡萄糖消耗率和乳酸生成率降低,線粒體質(zhì)量增加；敲低BT549細(xì)胞中內(nèi)源性Twist基因表達(dá)后,葡萄糖消耗率和乳酸生成率降低,線粒體質(zhì)量增加；低氧處理增加了葡萄糖消耗率和乳酸生成率,并使線粒體質(zhì)量降低。對MCF10A-Twist和MCF10A-Vector的mRNA芯片和蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示,MCF10A-Twist有10個與能量代謝相關(guān)的基因異常表達(dá)；qRT-PCR檢測的mRNA表達(dá)結(jié)果與mRNA芯片及蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致；Western Blot檢測結(jié)果顯示PKM2、LDHA、G6PD、pAKT表達(dá)上調(diào),p53表達(dá)下調(diào),低氧處理加劇了這一變化,且存在時間效應(yīng)關(guān)系。MCF10A-Twist重新敲除Twist基因后,PKM2、LDHA、G6PD、pAKT表達(dá)下調(diào),p53表達(dá)上調(diào)。與MCF10A細(xì)胞相比,BT549中PKM2、LDHA、G6PD、pAKT和p53表達(dá)均處于高水平；BT549經(jīng)低氧處理后PKM2、LDHA、G6PD、pAKT和p53表達(dá)均上調(diào)；BT549在敲除Twist基因后PKM2、LDHA、G6PD、pAKT表達(dá)下調(diào),p53表達(dá)上調(diào)。LY294002作用后,MCF10A-Twist不僅表現(xiàn)出葡萄糖消耗率和乳酸生成率降低,線粒體質(zhì)量增加,而且pAKT、PKM2、LDHA的表達(dá)下調(diào),但G6PD和P53的表達(dá)未見明顯變化。MCF10A-Twist和BT549在沉默mTOR基因后,mTOR下游基因PKM2和LDHA表達(dá)均下調(diào)。MCF10A-Vector在沉默內(nèi)源野生型p53基因后,G6PD表達(dá)上調(diào)；MCF10A-Twist中過表達(dá)野生型p53基因后,G6PD表達(dá)下調(diào)。WesternBlot結(jié)果顯示G6PD表達(dá)水平從高到低依次為MCF7、BT549、MCF10A;p53表達(dá)水平從高到低依次為BT549、MCF10A,MCF7。BT549在沉默內(nèi)源突變型p53基因后,G6PD表達(dá)無明顯變化；BT549在過表達(dá)野生型p53基因后,G6PD表達(dá)下調(diào)。經(jīng)抑制劑LY294002作用后,MCF10A-Twist和BT549的遷移能力均減弱,且EMT標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)上調(diào),N-cadherin和Vimentin表達(dá)下調(diào)；MCF10A-Twist在過表達(dá)野生型p53基因后細(xì)胞遷移能力減弱,BT549在沉默內(nèi)源突變型p53基因后或過表達(dá)野生型p53基因后細(xì)胞遷移能力均減弱,且細(xì)胞在恢復(fù)野生型p53基因表達(dá)后E-cadherin表達(dá)上調(diào),N-cadherin口Vimentin表達(dá)下調(diào)。結(jié)論：在Twist高表達(dá)的乳腺上皮細(xì)胞及乳腺癌細(xì)胞中,Twist能夠通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路上調(diào)糖酵解途徑關(guān)鍵酶PKM2和LDHA,同時通過抑制p53信號通路解除其對磷酸戊糖途徑關(guān)鍵酶G6PD的抑制作用,從而促進(jìn)能量代謝模式的轉(zhuǎn)變,即從氧化磷酸化途徑向糖酵解和磷酸戊糖途徑的轉(zhuǎn)變,使細(xì)胞發(fā)生能量代謝重塑,并為細(xì)胞的遷移及EMT等生物學(xué)過程提供能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：Twist 能量代謝重塑 乳腺腫瘤 遷移
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-18
• 前言18-20
• 1 材料與方法20-31
• 1.1 材料20-25
• 1.2 方法25-31
• 2 結(jié)果31-47
• 2.1 Twist引起MCF10A-Twist細(xì)胞能量代謝表型的改變31-34
• 2.2 Twist的表達(dá)缺失能部分逆轉(zhuǎn)Twist引起的能量代謝表型改變34-36
• 2.3 MCF10A-Twist細(xì)胞和Twist陽性的乳腺癌細(xì)胞中能量代謝相關(guān)基因的表達(dá)36-41
• 2.4 Twist通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路和抑制p53信號通路誘導(dǎo)能量代謝重塑的發(fā)生41-45
• 2.5 Twist誘導(dǎo)的能量代謝重塑增強(qiáng)了MCF10A-Twist細(xì)胞和Twist陽性的乳腺癌細(xì)胞的遷移能力,并促進(jìn)了細(xì)胞EMT過程45-47
• 3 討論47-51
• 參考文獻(xiàn)51-56
• 全文總結(jié)56-57
• 文獻(xiàn)綜述：腫瘤的能量代謝重塑57-70
• 參考文獻(xiàn)64-70
• 致謝70-71
• 攻讀博士學(xué)位期間撰寫的學(xué)術(shù)論文71-73
• 攻讀博士學(xué)位期間參與的科研項目73

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