發(fā)布時間：2017-09-22 12:37

  本文關(guān)鍵詞：叉頭蛋白FOXK2調(diào)控雌激素受體ERα的機理

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【摘要】：近年來,乳腺癌的發(fā)病率逐漸上升,嚴重影響女性的生活質(zhì)量。研究表明,雌激素受體(estrogen receptors, ERs)在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。ERa是一種類固醇核受體,具有促進腫瘤細胞生長和存活的作用,已成為激素依賴的乳腺癌治療的重要靶點之一。因此,鑒定對ERa功能具有調(diào)控作用的分子可以促進乳腺癌治療策略的發(fā)展。FOXK2是一種叉頭(forkhead box, FOX)蛋白轉(zhuǎn)錄因子。有研究表明,FOX家族的FOXA1和FOXO3a可以通過其保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(FKH domain)和ERa相互作用,并調(diào)控其功能,而FOXK2也具有FKH結(jié)構(gòu)域。因此,FOXK2蛋白對ERa的功能可能也具有調(diào)控作用。本研究從FOXK2與ERa的相互作用入手,探討了FOXK2對ERa介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控機理。本論文的主要工作如下：1.通過免疫組織化學(xué)實驗和免疫印跡實驗研究了FOXK2和ERα在乳腺癌中的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)FOXK2和ERa的蛋白水平在乳腺癌組織和乳腺癌細胞系中存在負相關(guān)。再使用FOXK2的全長和各缺失體,通過免疫共沉淀、哺乳動物細胞雙雜和免疫熒光等實驗,研究了FOXK2和ERa之間的相互作用。結(jié)果表明FOXK2通過其FKH結(jié)構(gòu)域和ERa相互作用,這種相互作用發(fā)生在細胞核內(nèi)。2.由于FOXK2ERα在乳腺癌組織和乳腺癌細胞中的蛋白水平呈負相關(guān),接下來通過免疫印跡實驗檢測了FOXK2對ERα蛋白水平的影響。結(jié)果表明FOXK2能夠縮短ERa的半衰期,并以劑量依賴的方式下調(diào)ERa的蛋白水平,但不影響其mRNA水平。進一步的研究發(fā)現(xiàn)FOXK2是通過促進ERa的泛素化降解降低其蛋白水平的。3. BARD1是ERa泛素E3連接酶BRCA1/BARD1的一個亞基,通過免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn),過表達FOXK2能夠增強ERα與BRCA1/BARD1之間相互作用,而沉默F(xiàn)OXK2的表達能夠減弱掉ERa與BRCA1/BARD1之間相互作用,表明FOXK2可以作為一個橋梁蛋白促進ERa與BRCA1/BARD1的結(jié)合,進而增強ERa的泛素化,導(dǎo)致其降解。4.進一步通過報告基因和Real-time PCR等實驗,研究了FOXK2對ERa的轉(zhuǎn)錄活性及其靶基因mRNA水平的影響。實驗結(jié)果表明FOXK2能夠抑制ERa的轉(zhuǎn)錄活性,并下調(diào)ERa下游靶基因如Cyclin D1和GREB1的mRNA水平。5.最后,通過細胞集落形成、MTT以及流式細胞儀等實驗檢測了FOXK2對乳腺癌細胞功能的影響,發(fā)現(xiàn)FOXK2能夠抑制ERα依賴的細胞增殖能力。本研究首次將FOXK2與ERα聯(lián)系起來,確定FOXK2是ERa的一個有效的負調(diào)控因子,能通過ERa抑制乳腺癌細胞的增殖,有助于闡述ERa介導(dǎo)的乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機理,為乳腺癌的治療提供理論依據(jù),為ERα介導(dǎo)的疾病的治療開辟了新思路。
【關(guān)鍵詞】：抑癌基因 癌基因 乳腺癌 FOXK2 ERα BARD1
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-21
• 縮略表21-23
• 1 緒論23-43
• 1.1 核受體ER的研究進展24-32
• 1.1.1 ER的發(fā)現(xiàn)24
• 1.1.2 ER的結(jié)構(gòu)24-26
• 1.1.3 ER的轉(zhuǎn)錄26-31
• 1.1.4 ER與腫瘤的關(guān)系31-32
• 1.2 叉頭蛋白FOX家族的研究進展32-40
• 1.2.1 FOX家族32-33
• 1.2.2 FOX蛋白的結(jié)構(gòu)33-34
• 1.2.3 FOX蛋白的翻譯后修飾34-37
• 1.2.4 FOX蛋白與腫瘤37-40
• 1.3 本論文的選題依據(jù)和研究內(nèi)容40-43
• 1.3.1 選題依據(jù)40-41
• 1.3.2 研究內(nèi)容41-43
• 2 FOXK2與ERα在乳腺癌中的相關(guān)性43-51
• 2.1 引言43
• 2.2 儀器與試劑43-45
• 2.2.1 儀器43-44
• 2.2.2 試劑44-45
• 2.2.3 乳腺癌樣本45
• 2.3 實驗45-47
• 2.3.1 免疫組織化學(xué)45
• 2.3.2 細胞培養(yǎng)45
• 2.3.3 蛋白樣品制備45-46
• 2.3.4 Bradfold法測定蛋白濃度46
• 2.3.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)46-47
• 2.3.6 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot,WB)47
• 2.4 結(jié)果47-50
• 2.4.1 FOXK2和ERα在人乳腺癌組織中的相關(guān)性47-49
• 2.4.2 FOXK2和ERα在人乳腺癌細胞系中的相關(guān)性49-50
• 2.5 討論50
• 2.6 小結(jié)50-51
• 3 FOXK2與ERα之間的相互作用51-66
• 3.1 引言51
• 3.2 儀器與試劑51-54
• 3.2.1 儀器51-52
• 3.2.2 試劑52-53
• 3.2.3 菌種、細胞及質(zhì)粒53-54
• 3.3 實驗54-58
• 3.3.1 Flag-FOXK2截短缺失體質(zhì)粒構(gòu)建54-55
• 3.3.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化55
• 3.3.3 用質(zhì)粒小提中量試劑盒進行質(zhì)粒提取55-56
• 3.3.4 酶切鑒定56
• 3.3.5 質(zhì)粒測序56
• 3.3.6 細胞培養(yǎng)56
• 3.3.7 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染56-57
• 3.3.8 蛋白樣品制備57
• 3.3.9 Bradfold法測定蛋白濃度57
• 3.3.10 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)57
• 3.3.11 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot,WB)57
• 3.3.12 蛋白質(zhì)免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)57
• 3.3.13 哺乳動物細胞雙雜交(Mammalian two hybrid assay)57-58
• 3.3.14 免疫熒光(Immunofluorescence)58
• 3.4 結(jié)果58-64
• 3.4.1 內(nèi)源FOXK2和ERα之間的相互作用58-60
• 3.4.2 外源FOXK2和ERα之間的相互作用60-62
• 3.4.3 FOXK2和ERα之間相互作用區(qū)域的確定62-64
• 3.4.4 FOXK2和ERα在MCF-7細胞中的分布64
• 3.5 討論64-65
• 3.6 小結(jié)65-66
• 4 FOXK2對ERα蛋白水平的影響66-79
• 4.1 引言66
• 4.2 儀器與試劑66-68
• 4.2.1 儀器66-67
• 4.2.2 試劑67-68
• 4.2.3 菌種、細胞及質(zhì)粒68
• 4.3 實驗68-71
• 4.3.1 質(zhì)粒提取68
• 4.3.2 細胞培養(yǎng)68
• 4.3.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染68-69
• 4.3.4 蛋白樣品制備69
• 4.3.5 Bradfold法測定蛋白濃度69
• 4.3.6 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)69
• 4.3.7 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot,WB)69
• 4.3.8 蛋白質(zhì)免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)69
• 4.3.9 反轉(zhuǎn)錄PCR69-71
• 4.4 結(jié)果71-77
• 4.4.1 FOXK2對ERα蛋白水平的影響71-72
• 4.4.2 FOXK2對ERα mRNA水平的影響72-74
• 4.4.3 FOXK2對ERα蛋白降解的影響74
• 4.4.4 FOXK2對ERα蛋白穩(wěn)定性的影響74-76
• 4.4.5 FOXK2對ERα泛素化水平的影響76-77
• 4.5 討論77-78
• 4.6 小結(jié)78-79
• 5 BARD1在FOXK2調(diào)控ERα蛋白水平過程中的作用79-90
• 5.1 引言79
• 5.2 儀器與試劑79-81
• 5.2.1 儀器79-80
• 5.2.2 試劑80-81
• 5.2.3 菌種、細胞及質(zhì)粒81
• 5.3 實驗81-82
• 5.3.1 質(zhì)粒提取81
• 5.3.2 細胞培養(yǎng)81
• 5.3.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染81
• 5.3.4 蛋白樣品制備81
• 5.3.5 Bradfold法測定蛋白濃度81
• 5.3.6 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)81
• 5.3.7 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot,WB)81-82
• 5.3.8 蛋白質(zhì)免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)82
• 5.3.9 免疫熒光(Immunofluorescence)82
• 5.4 結(jié)果82-89
• 5.4.1 FOXK2與BARD1的相互作用82-84
• 5.4.2 FOXK2和BARD1相互作用結(jié)構(gòu)域的確定84-85
• 5.4.3 FOXK2和BARD1在MCF-7細胞中的分布85-86
• 5.4.4 FOXK2對ERα與BARD1相互作用的影響86-87
• 5.4.5 FOXK2和BARD1對ERα泛素化水平的影響87-89
• 5.5 討論89
• 5.6 小結(jié)89-90
• 6 FOXK2對ERα轉(zhuǎn)錄活性的影響90-102
• 6.1 引言90
• 6.2 儀器與試劑90-92
• 6.2.1 儀器90-91
• 6.2.2 試劑91
• 6.2.3 菌種、細胞及質(zhì)粒91-92
• 6.3 實驗92-94
• 6.3.1 質(zhì)粒提取92
• 6.3.2 細胞培養(yǎng)92
• 6.3.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染92
• 6.3.4 熒光素酶報告基因?qū)嶒?/span>92
• 6.3.5 蛋白樣品制備92
• 6.3.6 Bradfold法測定蛋白濃度92-93
• 6.3.7 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)93
• 6.3.8 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot,WB)93
• 6.3.9 反轉(zhuǎn)錄PCR93
• 6.3.10 實時定量PCR(Real-time-PCR)93-94
• 6.4 結(jié)果94-100
• 6.4.1 FOXK2對ERα轉(zhuǎn)錄活性的影響94-96
• 6.4.2 FOXK2缺失體對ERα轉(zhuǎn)錄活性的影響96-98
• 6.4.3 FOXK2對ERα下游靶基因mRNA水平的影響98-100
• 6.5 討論100-101
• 6.6 小結(jié)101-102
• 7 FOXK2對ERα促乳腺癌細胞增殖功能的影響102-111
• 7.1 引言102
• 7.2 儀器與試劑102-103
• 7.2.1 儀器102
• 7.2.2 試劑102
• 7.2.3 細胞及質(zhì)粒102-103
• 7.3 實驗103-104
• 7.3.1 質(zhì)粒提取103
• 7.3.2 細胞培養(yǎng)103
• 7.3.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染103
• 7.3.4 細胞集落形成103
• 7.3.5 MTT檢測細胞增殖103-104
• 7.3.6 流式細胞儀檢測細胞周期104
• 7.4 結(jié)果104-109
• 7.4.1 FOXK2對ERα促乳腺癌細胞增殖能力的影響104-108
• 7.4.2 FOXK2和ERα對乳腺癌細胞細胞周期的影響108-109
• 7.5 討論109-110
• 7.6 小結(jié)110-111
• 8 結(jié)論與展望111-113
• 8.1 結(jié)論111
• 8.2 創(chuàng)新點摘要111-112
• 8.3 展望112-113
• 參考文獻113-127
• 作者簡介127
• 攻讀博士學(xué)位期間科研項目及科研成果127-130
• 致謝130

，

本文編號：900876