本文關(guān)鍵詞：細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞在ITP患者血小板破壞中的作用及機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 免疫性血小板減少癥 大劑量地塞米松 血小板自身抗體 細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞 血小板去唾液酸化

【摘要】：原發(fā)免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia, ITP),是臨床上最常見的出血性疾病,以外周血中血小板數(shù)目減少為特點(diǎn)。輕者可無明顯出血癥狀,嚴(yán)重者可出現(xiàn)皮膚黏膜出血、月經(jīng)過多、甚至內(nèi)臟及顱內(nèi)出血,可危及生命。ITP患者因出血風(fēng)險(xiǎn)增大、疾病轉(zhuǎn)歸的不可預(yù)測性、對疾病的恐懼感、需長時(shí)間治療、社會活動減少、影響工作等各種因素導(dǎo)致生活質(zhì)量嚴(yán)重降低,甚至低于癌癥患者。ITP的發(fā)病機(jī)制主要為血小板破壞增多、血小板生成減少及T淋巴細(xì)胞免疫失衡。ITP的一線治療方法主要包括：糖皮質(zhì)激素、靜脈注射用免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin, IVIG)和抗-D免疫球蛋白(anti-D immunoglobulin, anti-D);二線治療方法包括：脾臟切除術(shù)、促血小板生成素受體(thrombopoietin receptor,TPO-R)激動劑、利妥昔單抗、環(huán)孢素和免疫抑制劑等。相當(dāng)一部分患者對一線及二線治療方法均反應(yīng)不佳,反復(fù)治療遷延不愈成為難治性ITP。深入研究ITP的發(fā)病機(jī)制并且探尋新的治療靶點(diǎn),對ITP的診治意義重大。ITP患者體內(nèi)血小板破壞增多主要為血小板自身抗體介導(dǎo),患者體內(nèi)免疫失耐受,產(chǎn)生了針對血小板糖蛋白(glycoprotein, GP)的自身抗體,主要為抗血小板GPIb/Ⅸ及GPIIb/Ⅲa抗體,該抗體可與血小板表面的GP抗原表位結(jié)合,介導(dǎo)血小板被脾臟網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中的單核巨噬細(xì)胞過度清除。然而,只有50%-70%的ITP患者血漿中可檢測到血小板自身抗體,且部分ITP患者對阻斷自身抗體介導(dǎo)的血小板破壞的治療方法反應(yīng)差,提示除血小板自身抗體之外,ITP中還有其他參與血小板破壞的途徑。研究發(fā)現(xiàn),ITP中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes, CTLs)可通過穿孔素、顆粒酶B直接裂解血小板,造成血小板破壞增多。并且,ITP中CTLs可導(dǎo)致骨髓巨核細(xì)胞成熟及凋亡障礙從而導(dǎo)致血小板生成減少。上述研究提示,CTLs在ITP的發(fā)病中起非常重要的作用。糖皮質(zhì)激素為ITP患者的一線治療藥物,既往認(rèn)為,常規(guī)劑量潑尼松為治療ITP首選的糖皮質(zhì)激素,近年來,大劑量地塞米松(high-dose dexamethasone, HD-DX M)因其起效時(shí)間短、副反應(yīng)發(fā)生率低等優(yōu)勢逐漸取代常規(guī)劑量潑尼松成為ITP患者首選的激素藥物。研究發(fā)現(xiàn),HD-DXM治療可有效降低ITP患者CD8+淋巴細(xì)胞在體外殺傷血小板的能力,提示減少CTLs介導(dǎo)的血小板直接裂解可能是地塞米松治療ITP患者的療效機(jī)制之一。CD8通常作為CTLs的標(biāo)記,然而,CD8+淋巴細(xì)胞可根據(jù)不同的分子標(biāo)記及功能分為不同的亞群。CD28為多數(shù)T細(xì)胞反應(yīng)所必須的共刺激信號,CD8+淋巴細(xì)胞中的CD28-細(xì)胞通常發(fā)揮免疫抑制功能,故CD8+CD28淋巴細(xì)胞也被稱為抑制性T細(xì)胞(suppressor T cells, Ts)。此外,CD8+淋巴細(xì)胞還包括CD8+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells, Tregs)。ITP發(fā)病中CD4+Tregs的數(shù)量及功能有較多研究,研究證實(shí),ITP患者體內(nèi)CD4+Tregs數(shù)量顯著降低,且免疫抑制功能顯著受損,地塞米松、利妥昔單抗、TPO-R激動劑等藥物可顯著改善ITP患者的CD4+Tregs的數(shù)量和／或功能。雖然CD8+Tregs較CD4+Tregs數(shù)量少,但其數(shù)量缺陷在多種自身免疫性疾病的發(fā)病及進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。然而,CD8+Tregs在ITP患者中的數(shù)量及作用尚不清楚,有待進(jìn)一步研究。除了血小板自身抗體及CTLs介導(dǎo)的血小板破壞外,肝細(xì)胞介導(dǎo)的去唾液酸化血小板的吞噬破壞成為近年來日益受到研究者重視的血小板破壞方式。血小板去唾液酸化是指血小板糖蛋白上的唾液酸基團(tuán)被唾液酸酶(neuraminidase, NA)剪切掉,暴露出β半乳糖(P-galactoses, βGals)殘基的過程,暴露的βGals被肝細(xì)胞無唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoprotein receptors, ASGPRs)所識別、結(jié)合并介導(dǎo)血小板在肝臟中被清除,是血小板清除的重要途徑。血小板去唾液酸化由NA催化,細(xì)菌或病毒感染導(dǎo)致的外源性NA增加和多種原因造成的NA轉(zhuǎn)位至細(xì)胞表面或釋放至細(xì)胞外進(jìn)而引起內(nèi)源性NA活性升高,均可引起血小板去唾液酸化,導(dǎo)致血小板在肝臟中清除破壞。研究發(fā)現(xiàn),在感染、血小板冷藏、自由基增多、衰老、血管損傷等可對血小板造成活化或者直接損傷的情況下,血小板內(nèi)的NA可轉(zhuǎn)位至細(xì)胞表面甚至釋放至細(xì)胞外,導(dǎo)致血小板去唾液酸化水平升高。由于ITP患者中血小板自身抗體和CTLs均可活化或損傷血小板,我們推測,血小板去唾液酸化可能參與ITP的發(fā)病。截至目前,ITP患者中血小板去唾液酸化的水平、與血小板自身抗體和CTLs的關(guān)系、對體內(nèi)血小板破壞的影響等均未闡明。我們以ITP患者及小鼠模型為研究對象,通過體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法,深入研究ITP患者外周血CD8+淋巴細(xì)胞亞群包括CTLs、Ts、Tregs的水平、HD-DXM治療后上述細(xì)胞亞群的變化、血小板去唾液酸化的水平及其對血小板破壞的影響、血小板自身抗體特異性及CTLs殺傷作用與血小板去唾液酸化的關(guān)系,深入揭示ITP患者體內(nèi)血小板破壞的新機(jī)制。第一部分：大劑量地塞米松對ITP中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞及GD8+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞調(diào)控作用的研究目的：檢測ITP患者和正常對照外周血中CD8+淋巴細(xì)胞各亞群比例,包括CTLs、 Ts、Tregs;檢測ITP患者和正常對照外周血血漿中轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)及白介素10 (interleukin 10, IL-10)的水平；檢測HD-DXM治療前后ITP患者CD8+淋巴細(xì)胞各亞群及血漿TGF-β1、IL-10水平的變化。明確ITP患者中是否存在CD8+淋巴細(xì)胞各亞群的數(shù)量異常,探討HD-DXM治療ITP可能的新機(jī)制。方法：1.入組21例初診的ITP患者,接受4天連續(xù)HD-DXM (40mg/d)治療,治療前收取外周血,治療開始14天后,評價(jià)臨床療效及副反應(yīng),并且收取外周血。同時(shí)入組16例健康志愿者作為正常對照。2.血常規(guī)檢測血小板數(shù)目,分離外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)及血漿。3.以APC-CD8、FITC-CD28、PE-Cy5-CD25及PE-Foxp3單克隆抗體標(biāo)記PBMCs,流式細(xì)胞術(shù)檢測ITP患者及正常對照淋巴細(xì)胞中CD8、CD28、CD25及Foxp3的表達(dá)情況。4.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(;nzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)檢測ITP患者及正常對照血漿中TGF-β1及IL-10水平。結(jié)果：1.接受HD-DXM治療的ITP患者,14天后完全反應(yīng)(complete response, CR)、反應(yīng)(response, R)及無反應(yīng)(：no response, NR)率分別為57.14%、28.57%及14.29%,均未出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)。2.ITP患者淋巴細(xì)胞中CD8+細(xì)胞比例與正常對照無明顯差別,并且HD-DXM治療前后ITP患者淋巴細(xì)胞中CD8+細(xì)胞比例也無明顯變化。3.ITP患者CD8+淋巴細(xì)胞中CTLs (CD8+CD28+)比例明顯高于正常對照,同時(shí)Ts細(xì)胞(CD8+CD28)比例低于正常對照。HD-DXM治療可有效降低ITP患者CD8+淋巴細(xì)胞中CTLs比例同時(shí)升高Ts細(xì)胞比例。4.ITP患者CD8+淋巴細(xì)胞中regs (CD8+CD25+、CD8+Foxp3+)比例明顯低于正常對照,HD-DXM可在一定程度上提高其比例。5.ITP患者血漿中TGF-β1及IL-10的濃度均顯著低于正常對照,HD-DXM治療后,ITP患者血漿中TGF-β1濃度顯著升高至正常水平,IL-10濃度也顯著升高,但仍低于正常水平。結(jié)論：1.CD8+淋巴細(xì)胞中CTLs比例升高、Ts及Tregs比例下降可能參與ITP的發(fā)病。2. HD-DXM治療可顯著降低CD8+淋巴細(xì)胞中CTLs比例同時(shí)升高CD8+淋巴細(xì)胞中Ts及Tregs比例,可能是HD-DXM治療ITP的療效機(jī)制之一。第二部分：ITP中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞導(dǎo)致血小板去唾液酸化的機(jī)制研究目的：檢測ITP患者和正常對照血小板自身抗體、CTLs介導(dǎo)的血小板破壞及血小板去唾液酸化水平,分析血小板去唾液酸化水平與血小板自身抗體特異性及CTLs介導(dǎo)的血小板破壞的相關(guān)性；檢測ITP患者治療前后的血小板去唾液酸化水平,分析其與療效的關(guān)系；將ITP患者血漿及CTLs與血小板體外共同孵育,檢測孵育后血小板去唾液酸化及唾液酸酶1(neuraminidase 1,Neul)表達(dá)水平；利用動物實(shí)驗(yàn)明確去唾液酸化的血小板在肝臟中的破壞情況。從而明確ITP患者中是否存在血小板去唾液酸化水平的異常,血小板去唾液酸化水平在ITP病程進(jìn)展中的變化,血小板自身抗體及CTLs是否可引起血小板去唾液酸化及具體機(jī)制,以及去唾液酸化的血小板在體內(nèi)的破壞情況。方法：1.收取活動性ITP患者治療前后及正常對照外周血,血常規(guī)檢測血小板數(shù)目,離心獲取血漿、PBMCs及血小板。2.流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板表面去唾液酸化后暴露的βGals的水平,即以PE-Cy5-CD41 a單克隆抗體標(biāo)記血小板,并同時(shí)標(biāo)以FITC-RCA-I,RCA-I的平均熒光強(qiáng)度用來反映血小板去唾液酸化水平。3.改良直接單克隆抗體俘獲血小板抗原技術(shù)(monoclonal antibody-specific immobilization of platelet antigens,MAIPA)檢測ITP患者血漿中的抗血小板 GPIb.GPIIb/Ⅲa抗體。4.CTLs殺傷實(shí)驗(yàn)檢測ITP患者及正常對照CD8+淋巴細(xì)胞在體外對血小板的殺傷作用。即免疫磁珠分選CD8+淋巴細(xì)胞,體外與血小板共培養(yǎng)4小時(shí),線粒體膜電位法檢測血小板凋亡。5.ITP患者及正常對照血漿及CTLs體外與血小板共同孵育后,流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板去唾液酸化水平,同時(shí)標(biāo)記anti-Neu1抗體,檢測血小板表面Neul的表達(dá)。6.野生小鼠血小板免疫CD61敲除鼠,免疫后分選CD61敲除鼠的CD8+脾細(xì)胞,體外與熒光標(biāo)記的野生小鼠血小板共同孵育,孵育后將血小板通過尾靜脈注射回輸至野生小鼠體內(nèi),30min后處死小鼠,收取肝臟,冰凍切片,免疫熒光法檢測小鼠肝臟中血小板破壞情況。結(jié)果：1.ITP患者血小板RCA-I的平均熒光強(qiáng)度顯著高于正常對照。ITP患者治療后CR、R及NR率分別為19.36%、45.16%及35.48%,CR及R患者治療后RCA-I的平均熒光強(qiáng)度較治療前顯著降低,而NR患者治療前后RCA-I的平均熒光強(qiáng)度無顯著差異。2.ITP患者中17.57% GPIb抗體單陽性,13.51%GPⅡb/Ⅲa抗體單陽性,21.62%兩者均陽性,47.30%兩者均陰性。GPIb抗體陽性組及陰性組,GPⅡb/Ⅲa抗體陽性組與陰性組,血小板抗體陽性組與陰性組,血小板RCA-I的平均熒光強(qiáng)度均無顯著差異。血小板在體外與血漿共孵育后,不同ITP血漿組,即GPIb抗體陽性組、GPⅡb/Ⅲa抗體陽性組、雙陽性組和雙陰性組之間,血小板RCA-I及Neul的平均熒光強(qiáng)度無顯著差異。3.ITP患者CTLs誘導(dǎo)的血小板凋亡顯著高于正常對照,根據(jù)誘導(dǎo)的血小板凋亡情況,我們將ITP患者分為兩組：殺傷組(誘導(dǎo)的血小板凋亡正常對照均值+2倍標(biāo)準(zhǔn)差)及無殺傷組(剩余ITP患者),殺傷組及無殺傷組所占ITP患者的比例分別為55%及45%。殺傷組ITP患者直接檢測的血小板RCA-I平均熒光強(qiáng)度顯著高于無殺傷組ITP患者。殺傷組ITP患者CTLs體外與血小板共同孵育后,血小板RCA-I及Neul平均熒光強(qiáng)度均顯著升高,并且可被NA抑制劑DANA所抑制,而正常對照及無殺傷組CTLs則無此效果。4.野生小鼠血小板和免疫過的CD61敲除鼠的CD8+脾細(xì)胞共同孵育后回輸至野生小鼠體內(nèi),免疫熒光結(jié)果顯示,肝細(xì)胞吞噬的血小板顯著高于對照組,并且可被NA抑制劑DANA所抑制。結(jié)論：1.ITP患者血小板去唾液酸化水平顯著高于正常對照,治療后有效的ITP患者血小板去唾液酸化水平降低,而無效的ITP患者血小板去唾液酸化水平無明顯變化,說明血小板去唾液酸化水平的升高可能與ITP的發(fā)病與進(jìn)展密切相關(guān),抑制血小板去唾液酸化或?qū)⒊蔀橹委烮TP的新手段。2.ITP中血小板去唾液酸化水平與血小板自身抗體特異性無明顯相關(guān)。3.ITP中CTLs可通過誘導(dǎo)血小板去唾液酸化水平升高進(jìn)而引起血小板在肝臟中破壞增加,可能是ITP中血小板破壞的新機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：免疫性血小板減少癥 大劑量地塞米松 血小板自身抗體 細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞 血小板去唾液酸化
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R575.2
【目錄】：

• 中文摘要6-14
• 英文摘要14-22
• 符號說明22-25
• 第一部分：大劑量地塞米松對ITP中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞及CD8~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞調(diào)控作用的研究25-58
• 前言25-29
• 材料方法29-34
• 結(jié)果34-37
• 討論37-41
• 結(jié)論41-42
• 附圖表42-51
• 參考文獻(xiàn)51-58
• 第二部分：ITP中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞引起血小板去唾液酸化的機(jī)制研究58-100
• 前言58-61
• 材料方法61-73
• 結(jié)果73-77
• 討論77-82
• 結(jié)論82-83
• 附圖表83-94
• 參考文獻(xiàn)94-100
• 第三部分：綜述100-118
• References110-118
• 附錄118-167
• 致謝167-168
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表論文及參加學(xué)術(shù)會議168-169
• 附件169

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 段_g;;原發(fā)性血小板減少性紫癜新進(jìn)展[J];醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐;1988年03期

2 易錦錦;劉江龍;曾金香;;中藥治療原發(fā)性血小板減少性紫癜72例療效觀察[J];臨床合理用藥雜志;2014年11期

3 孫禎甫;婁世鋒;;成人免疫性血小板減少性紫癜的治療進(jìn)展[J];現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生;2008年03期

4 王偉林,張曉群,林建燦;脾切除治療原發(fā)性血小板減少性紫癲的療效觀察[J];浙江預(yù)防醫(yī)學(xué);1998年01期

5 住昌明;特發(fā)性血小板減少性紫癜的治療[J];新醫(yī)學(xué);1986年11期

6 楊國元;唐錦治;;成人難治性特發(fā)性血小板減少性紫癜的治療[J];臨床內(nèi)科雜志;1993年04期

7 高鳳鳴;中西醫(yī)結(jié)合治療特發(fā)性血小板減少性紫癜37例[J];天津中醫(yī);1999年01期

8 張勝敏;;特發(fā)性血小板減少性紫癜怎樣治療[J];老友;2007年09期

9 莊萬傳;夏瑞祥;;特發(fā)性血小板減少性紫癜研究進(jìn)展[J];安徽醫(yī)學(xué);2010年10期

10 鄭波;鄭漪;;成人慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜的治療進(jìn)展[J];寧夏醫(yī)學(xué)雜志;1991年02期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 善培元;;激素治療原發(fā)性血小板減少性紫癜可出現(xiàn)哪些副作用[A];玉溪市第十三屆內(nèi)科學(xué)術(shù)年會論文集[C];2009年

2 阮長耿;;血小板減少癥的研究進(jìn)展[A];中華醫(yī)學(xué)會第八次全國血液學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2004年

3 顧東生;杜偉廷;薛峰;葛菁;趙海豐;隋濤;馬麗;李慧媛;齊愛萍;楊仁池;;Th1(CXCL10)和Th2(CCL2)趨化因子在ITP表達(dá)及其臨床意義的初步研究[A];第12屆全國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會議論文摘要[C];2009年

4 沈一平;;血小板減少癥[A];全國中西醫(yī)結(jié)合血液病學(xué)術(shù)研討會、浙江省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會血液病專業(yè)委員會成立大會首次學(xué)術(shù)年會暨繼續(xù)教育學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2006年

5 崔彩霞;;以咽痛為首發(fā)癥狀的嚴(yán)重特發(fā)性血小板減少性紫癜1例[A];華東六省一市耳鼻咽喉-頭頸外科學(xué)術(shù)會議暨2008年浙江省耳鼻咽喉-頭頸外科學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2008年

6 匡躍敏;黃黎;蔣志勇;;幽門螺桿菌感染與特發(fā)性血小板減少性紫癜的關(guān)系[A];2005年華東六省一市血液病學(xué)學(xué)術(shù)會議暨浙江省血液病學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2005年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 邱繼花;細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞在ITP患者血小板破壞中的作用及機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2015年

，

本文編號：900865