本文關鍵詞：移植外源性MSCs持久恢復宿主MSCs功能的機制研究

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【摘要】：【研究背景】近年來,MSCs治療已被廣泛應用到多種人類疾病的治療中。研究表明,在動物模型以及臨床應用中,MSCs治療可以有效緩解移植物抗宿主病(Gv HD)、風濕性關節(jié)炎、炎性腸道疾病、心肌梗死、肝纖維化和多發(fā)性硬化癥等疾病的癥狀。我們的前期研究結果也表明MSCs治療可以有效緩解系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)癥狀、促進皮膚創(chuàng)傷愈合過程中的血管化、殺傷多發(fā)性骨髓瘤、抑制皮膚增生性瘢痕和聲帶瘢痕。在嘗試利用MSCs治療多種疾病的同時,研究者也在不斷地探索MSCs產(chǎn)生療效的機制。早期研究表明移植的供體MSCs可以在宿主體內(nèi)存活,并且可以分化為多種成體細胞促進組織再生。隨后,越來越多的實驗證據(jù)表明,在大多數(shù)情況下,供體MSCs并不會在宿主體內(nèi)存在足夠長的時間并通過分化過程產(chǎn)生療效。相反,越來越多的證據(jù)表明,MSCs可以通過分泌包括PGE2、TSG-6、VEGF和IL-10等多種可溶性細胞因子調(diào)節(jié)免疫細胞功能、促進血管化或促進組織再生。同時,也有研究證明供體MSCs可以直接與宿主免疫細胞相互作用并誘導免疫耐受。盡管目前MSCs治療的一些機制得以闡明,但是很多在MSCs治療應用過程中觀察到的現(xiàn)象尚未得到解釋,MSCs產(chǎn)生療效的機制也尚未得到全面的闡明。其中,非常令人關注的是,在對絕大多數(shù)動物疾病模型和病人實施MSCs治療過程中,MSCs移植通常只進行一次,但是MSCs治療所產(chǎn)生的療效卻可以持續(xù)較長的時間,這些證據(jù)表明MSCs治療可能通過穩(wěn)定調(diào)節(jié)宿主細胞的功能產(chǎn)生持久的療效,也就是產(chǎn)生了療效的“記憶”。目前,這種MSCs治療所產(chǎn)生的穩(wěn)定療效的機制尚待闡明。表觀遺傳調(diào)控是指在不改變DNA序列的情況下進行的穩(wěn)定的基因表達調(diào)控,主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾以及mi RNA等方式。大量的研究表明,表觀遺傳調(diào)控在疾病的發(fā)生發(fā)展以及維持疾病性狀中起到了重要的作用。同時,利用多種治療手段通過干預疾病狀態(tài)下異常的表觀遺傳狀態(tài)可以產(chǎn)生持久的療效。綜上所述,我們提出假設:在MSCs治療過程中,供體MSCs可以通過調(diào)節(jié)宿主細胞的表觀遺傳狀態(tài)產(chǎn)生穩(wěn)定的治療效果。在前期研究中我們發(fā)現(xiàn),與系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人相似,系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠(MRL/lpr小鼠,含F(xiàn)as基因突變)具有受損的BMMSCs成骨分化潛能和顯著的骨質疏松癥狀。同時我們發(fā)現(xiàn),單次MSCs治療可以持久和有效地恢復MRL/lpr小鼠BMMSCs的成骨分化潛能并緩解MRL/lpr小鼠的骨質疏松癥狀。在本研究中,我們利用MRL/lpr小鼠模型探索MSCs治療產(chǎn)生持久療效的分子調(diào)控機制�！狙芯磕康摹吭贛RL/lpr小鼠模型中,明確系統(tǒng)注射MSCs所產(chǎn)生的逆轉骨質疏松癥狀并恢復宿主BMMSCs成骨分化功能的持久性療效,探索表觀遺傳調(diào)控尤其是DNA甲基化修飾在MSCs治療所產(chǎn)生的持久性療效中的作用,闡明供體MSCs如何調(diào)節(jié)宿主BMMSCs的表觀遺傳學特性。本研究為逆轉異常的表觀遺傳狀態(tài)提供新的干預手段,并為MSCs治療的臨床應用提供進一步的理論支持�！狙芯糠椒ā�1.MSCs治療產(chǎn)生的短期和持久療效。在MRL/lpr小鼠模型中,以系統(tǒng)注射的方式進行MSCs治療,通過μCT和鈣黃綠素雙標實驗觀察MSCs治療對骨質疏松癥狀的短期及長期療效,并通過茜素紅染色、Western blot以及裸鼠皮下埋植成骨觀察MSCs治療對MRL/lpr小鼠BMMSCs成骨分化功能恢復的短期及長期療效。2.MSCs治療對宿主BMMSCs甲基化狀態(tài)的調(diào)節(jié)。通過DNA甲基化芯片分析MSCs治療前后MRL/lpr小鼠BMMSCs全基因組DNA甲基化模式的變化,觀察DNA甲基化抑制劑5-Azacytidine對MSCs治療效果的抑制作用。3.宿主BMMSCs的Notch信號通路相關基因的甲基化水平及其功能。利用DNA甲基化芯片分析與BMMSCs成骨分化功能相關的Notch信號通路基因的DNA甲基化水平的變化,利用亞硫酸鹽測序法對其進行驗證,利用Western Blot明確MSCs治療前后Notch信號通路相關基因的表達,在體外實驗和體內(nèi)實驗中觀察Notch信號通路的抑制劑DAPT對恢復MRL/lpr小鼠BMMSCs功能的和緩解MRL/lpr小鼠骨質疏松癥狀的作用。4.Dnmt1對Notch信號通路相關基因甲基化水平的調(diào)控。利用Western Blot檢測MSCs治療前后MRL/lpr小鼠BMMSCs中Dnmt1的表達,利用si RNA和茜素紅染色觀察Dnmt1在小鼠BMMSCs成骨分化中的作用,通過si RNA和過表達質粒分別抑制和過表達Dnmt1,結合DAPT的使用進一步檢測Dnmt1通過Notch信號通路調(diào)控BMMSCs成骨分化功能。5.mi R-29b對Dnmt1表達水平的調(diào)控。利用micro RNA芯片分析篩選MSCs治療前后恢復表達的micro RNA并利用real-time PCR明確mi R-29b的表達水平,在體內(nèi)實驗中使用inhibitor抑制mi R-29b的表達,并觀察其對Dnmt1的表達、對Notch信號通路的調(diào)節(jié)以及對MRL/lpr小鼠BMMSCs成骨分化功能的恢復和骨質疏松癥狀的緩解作用,利用mimics過表達mi R-29b,并觀察其對Dnmt1的表達、對Notch信號通路的調(diào)節(jié)以及對BMMSCs成骨分化功能的抑制作用。6.供體MSCs來源的exosome對宿主BMMSCs的mi R-29b水平的調(diào)控。利用transwell建立正常小鼠BMMSCs和MRL/lpr小鼠BMMSCs共培養(yǎng)體系,觀察共培養(yǎng)對MRL/lpr小鼠BMMSCs功能的恢復作用。通過使用si RNA抑制Rab27a的表達從而抑制exosome的分泌,明確exosome分泌在共培養(yǎng)體系及在MSCs治療中的作用。系統(tǒng)注射exosome,觀察exosome治療對MRL/lpr小鼠BMMSCs的Dnmt1和Notch信號通路的調(diào)節(jié)、對其BMMSCs功能的恢復以及對骨質疏松癥狀的緩解。7.宿主BMMSCs利用供體來源的Fas蛋白控制mi R-29b的分泌。利用si RNA和過表達質粒分別抑制和過表達Fas,觀察Fas對mi R-29b分泌的調(diào)控作用,分別使用正常小鼠和MRL/lpr小鼠BMMSCs來源exosome和MRL/lpr小鼠BMMSCs共培養(yǎng),觀察不同來源exosome對MRL/lpr小鼠BMMSCs分泌mi R-29b功能的調(diào)控,構建Fas-EGFP融合蛋白用以對Fas蛋白示蹤,將表達Fas-EGFP融合蛋白的exosome與MRL/lpr小鼠BMMSCs共培養(yǎng)并系統(tǒng)注射,觀察免疫熒光染色觀察MRL/lpr小鼠BMMSCs中Fas-EGFP融合蛋白的表達�！狙芯拷Y果】1.MSCs治療產(chǎn)生了持久的療效。與正常對照小鼠(C3H/He J小鼠)來源的BMMSCs相比較,MRL/lpr小鼠來源的BMMSCs具有較低的體內(nèi)和內(nèi)外成骨分化潛能。同時,與正常對照小鼠相比較,MRL/lpr小鼠具有顯著的骨質疏松癥狀。實施MSCs治療4星期之后,MSCs治療顯著的恢復了MRL/lpr小鼠BMMSCs受損的成骨分化潛能,并且顯著的緩解了MRL/lpr小鼠的骨質疏松癥狀。更為重要的是,實施MSCs治療12星期后,MSCs治療依然保持了對MRL/lpr小鼠BMMSCs成骨分化功能的恢復和骨質疏松的緩解作用。2.MSCs治療恢復了MRL/lpr小鼠BMMSCs的DNA甲基化狀態(tài)。MRL/lpr小鼠的BMMSCs具有異常的全基因組DNA甲基化模式和較低的甲基化水平,MSCs治療以后,這種異常的模式和水平得到了恢復。DNA甲基化抑制劑5-Azacytidine顯著抑制了MSCs治療對MRL/lpr小鼠BMMSCs成骨分化功能的恢復和對骨質疏松癥狀的緩解。3.MSCs治療恢復了宿主BMMSCs的Notch通路相關基因的DNA甲基化水平。MRL/lpr小鼠的BMMSCs的Notch通路相關基因具有較低的DNA甲基化水平和較高的表達水平,MSCs治療恢復了MRL/lpr小鼠BMMSCs的Notch通路相關基因甲基化水平并恢復了Notch信號通路的激活水平。在體內(nèi)和體外實驗中,DAPT顯著的恢復了MRL/lpr小鼠的成骨分化能力并顯著的緩解了MRL/lpr小鼠的骨質疏松癥狀。4.Dnmt1調(diào)控Notch通路相關基因的DNA甲基化水平。MRL/lpr小鼠的BMMSCs的Dnmt1表達水平較低。在C3H/He J小鼠的BMMSCs中,降低Dnmt1的表達可以降低Notch1甲基化水平,激活Notch通路并抑制BMMSCs的成骨分化。在MRL/lpr小鼠的BMMSCs中,過表達Dnmt1可以恢復MRL/lpr小鼠BMMSCs的Notch1的DNA甲基化水平和Notch通路表達水平,并恢復其成骨分化能力。5.mi R-29b負調(diào)控Dnmt1的表達。MRL/lpr小鼠BMMSCs具有高表達的miR-29b水平,MSCs治療恢復了MRL/lpr小鼠BMMSCs的mi R-29b水平。在體內(nèi)實驗中,抑制mi R-29b的表達可以顯著恢復MRL/lpr小鼠BMMSCs的Notch1和Dnmt1表達,恢復其BMMSCs成骨分化能力并緩解其骨質疏松癥狀。在正常對照小鼠的BMMSCs中,過表達mi R-29b可以抑制Dnmt1表達、降低Notch1基因DNA甲基化水平、激活Notch通路并抑制BMMSCs的成骨分化能力。6.供體MSCs分泌exosome下調(diào)宿主BMMSCs的mi R-29b表達。與正常對照小鼠BMMSCs共培養(yǎng)可以恢復MRL/lpr小鼠BMMSCs的mi R-29b、Dnmt1和Notch1的表達水平并恢復其成骨分化能力,抑制正常小鼠BMMSCs的exosome分泌可以削弱這種恢復作用。同時,抑制供體MSCs的exosome分泌顯著削弱了MSCs治療對MRL/lpr小鼠BMMSCs的mi R-29b、Dnmt1和Notch1表達水平的恢復和對其成骨分化能力的恢復。直接注射exosome顯著恢復了MRL/lpr小鼠BMMSCs的mi R-29b、Dnmt1和Notch1表達水平、恢復了其成骨分化能力并緩解了MRL/lpr小鼠骨質疏松癥狀。7.宿主BMMSCs利用供體exosome來源的Fas蛋白釋放胞內(nèi)的mi R-29b。在正常小鼠的BMMSCs中,抑制Fas的表達可以提高胞內(nèi)mi R-29b的量并抑制mi R-29b的釋放;同時,在MRL/lpr小鼠BMMSCs中,過表達Fas可以降低胞內(nèi)mi R-29b的量并促進mi R-29b的釋放。Fas的抑制和過表達不影響mi R-29b的原始轉錄水平。正常小鼠BMMSCs來源的exosome可恢復MRL/lpr小鼠BMMSCs胞內(nèi)和分泌mi R-29b的水平,而MRL/lpr小鼠BMMSCs來源的exosome沒有此功能。將含有Fas-EGFP融合蛋白的exosome與MRL/lpr小鼠BMMSCs共培養(yǎng)或給予MRL/lpr小鼠系統(tǒng)注射后,均可在MRL/lpr小鼠BMMSCs中觀察到融合蛋白的表達�！狙芯拷Y論】本研究證實,在MRL/lpr小鼠模型中,Fas蛋白功能的缺失導致mi R-29b分泌受阻進而導致mi R-29b胞內(nèi)水平升高,而高水平的mi R-29b通過抑制Dnmt1的表達降低了Notch通路相關基因的DNA甲基化水平從而激活Notch通路。最終,Notch通路的激活抑制了MRL/lpr小鼠BMMSCs的成骨分化能力并導致了其骨質疏松癥狀。實施MSCs治療后,供體MSCs分泌了含有正常功能Fas蛋白的exosome,MRL/lpr小鼠BMMSCs通過exosome利用了供體來源的Fas蛋白促進胞內(nèi)mi R-29b的釋放,進而恢復了Dnmt1和Notch通路相關基因的DNA甲基化水平和表達水平,最終持久性的恢復了MRL/lpr小鼠BMMSCs的成骨分化能力并緩解了其骨質疏松癥狀。在本研究中,我們通過闡明Fas/mi R-29b/Dnmt1/Notch所組成的表觀遺傳調(diào)控通路,首次揭示了MSCs治療產(chǎn)生持久療效的機制,證明了干細胞治療可以通過表觀遺傳調(diào)控穩(wěn)定的調(diào)節(jié)宿主細胞的功能,為逆轉疾病發(fā)生過程中異常的表觀遺傳調(diào)控提供了新的治療手段。同時,我們還首次發(fā)現(xiàn),供體細胞來源的細胞成分可以被宿主細胞再次利用,以恢復其自身的功能,提示供體細胞和宿主細胞之間的相互交流在干細胞治療過程中發(fā)揮重要作用。本研究為干細胞治療的臨床應用提供了進一步的理論依據(jù)。
【關鍵詞】：MSCs治療 表觀遺傳 骨質疏松 miRNA Notch
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R457.7
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-13
• Abstract13-20
• 前言20-21
• 文獻回顧21-38
• 第一部分MSCs治療持久恢復宿主BMMSCs的成骨分化功能38-50
• 1 材料38-40
• 2 方法40-43
• 3 結果43-48
• 4 討論48-50
• 第二部分MSCs治療恢復宿主BMMSCs Notch通路相關基因的DNA甲基化水平50-65
• 1 材料50-51
• 2 方法51-53
• 3 結果53-63
• 4 討論63-65
• 第三部分mi R-29b通過抑制Dnmt1調(diào)節(jié)Notch通路相關基因的DNA甲基化水平65-80
• 1 材料65-66
• 2 方法66-68
• 3 結果68-78
• 4 討論78-80
• 第四部分 宿主BMMSCs再利用供體MSCs來源的exosomes中的Fas蛋白調(diào)控mi R-29b/Dnmt1/Notch180-101
• 1 材料80-82
• 2 方法82-85
• 3 結果85-99
• 4 討論99-101
• 小結101-103
• 參考文獻103-127
• 個人簡歷和研究成果127-131
• 致謝131-132

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本文編號：899254