本文關(guān)鍵詞：Angiogenin對滋養(yǎng)細胞侵襲和遷移功能的影響及相關(guān)miRNA機制研究

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【摘要】：滋養(yǎng)細胞(trophoblast,TB)是構(gòu)成哺乳動物胎盤組織的重要功能細胞,在正常早期妊娠過程中,滋養(yǎng)細胞通過“節(jié)制性”的“生理侵襲”能力到達子宮肌層約1/3處的母體蛻膜組織,促使螺旋動脈重鑄、擴張,進而滿足正常生理妊娠過程中母胎間的營養(yǎng)供給和血液供應(yīng)。正常生理狀態(tài)下,滋養(yǎng)細胞的這種“生理性侵襲”具有明顯的時間性和空間性,即滋養(yǎng)細胞的侵襲功能僅發(fā)生在妊娠早期階段,在妊娠12周時達到高峰,然后逐漸減弱在妊娠14-20周時基本結(jié)束;同時滋養(yǎng)細胞僅侵襲到子宮肌層1/3處,而對深層組織無影響。病理狀態(tài)下,滋養(yǎng)細胞侵襲功能異常將直接導致妊娠相關(guān)疾病的發(fā)生,如滋養(yǎng)細胞過度侵襲,破壞周圍組織會導致絨毛膜癌等腫瘤疾病的發(fā)生;而在子癇前期(preeclampsia,PE)發(fā)病過程中,由于多種因素共同作用導致滋養(yǎng)細胞植入深度不足,進而使螺旋動脈的植入和重鑄受到限制,最終導致流產(chǎn)、胎盤缺血、發(fā)育受限等。由此可見,滋養(yǎng)細胞的這種“生理性的侵襲功能”是受精卵的成功植入和胚胎發(fā)育的重要前提,但目前關(guān)于其侵襲功能的具體調(diào)控機制尚不完全清楚。本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn),5%蛻膜基質(zhì)條件培養(yǎng)液(decidual stromal conditioned medium,DSCM)處理后的HTR-8/SVneo細胞侵襲和遷移能力明顯增強,同時MMP-2表達水平和酶活性顯著增強;而20%DSCM處理后HTR-8/SVneo細胞侵襲和遷移能力明顯減弱,MMP-2表達及酶活性顯著降低。隨后我們通過蛋白芯片比對不同處理組中差異表達的細胞因子后發(fā)現(xiàn),5%DSCM處理后的HTR8/SVneo細胞中angiogenin表達明顯增加,而20%DSCM處理后angiogenin表達顯著減低,angiogenin表達水平與滋養(yǎng)細胞侵襲能力密切相關(guān),因此推測angiogenin可能對滋養(yǎng)細胞侵襲和遷移功能發(fā)揮重要調(diào)控作用。目的及方法針對上述問題,在前期研究的基礎(chǔ)上,我們擬通過q PCR和Western blot方法明確Angiogenin在不同滋養(yǎng)細胞系和臨床樣本中的表達;在構(gòu)建過表達質(zhì)粒和si RNA的基礎(chǔ)上,使用Transwell實驗和劃痕實驗驗證Angiogenin對滋養(yǎng)細胞侵襲和遷移功能的調(diào)控作用;通過q PCR、Western blot、報告基因?qū)嶒灪凸δ芡炀葘嶒灥确椒U明參與Angiogenin調(diào)控的可能mi RNA機制;通過對正�；颊吆蚉E患者臨床樣本中Angiogenin等相關(guān)因子的相關(guān)性分析進一步論證Angiogenin及其相關(guān)mi RNA機制在PE發(fā)病中的作用。結(jié)果本課題研究結(jié)果可以分為以下4個部分,具體如下:1.Angiogenin在不同DSCM處理組細胞和臨床樣本中的表達分析:首先我們對芯片數(shù)據(jù)進行了q PCR驗證,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與芯片結(jié)果一致,使用不同DSCM處理后滋養(yǎng)細胞的侵襲和遷移能力與細胞中Angiogenin的表達明顯相關(guān),具有較強侵襲能力的絨毛膜癌細胞JEG-3中Angiogenin表達明顯高于正常滋養(yǎng)細胞HTR8/SVneo,子癇前期患者胎盤組織中Angiogenin表達顯著低于正常妊娠患者。本部分研究結(jié)果提示Angiogenin可能參與了滋養(yǎng)細胞侵襲和遷移功能調(diào)控。2.Angiogenin對滋養(yǎng)細胞侵襲和遷移功能的影響:為了證實Angiogenin對滋養(yǎng)細胞功能的影響,我們首先設(shè)計并構(gòu)建了Angiogenin的過表達質(zhì)粒p CMV-ANG,通過質(zhì)粒測序和Western blot結(jié)果證實其構(gòu)建成功;使用p CMV-ANG過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染滋養(yǎng)細胞系HTR8/SVneo后,通過Transwell實驗和劃痕實驗發(fā)現(xiàn)其可以明顯促進滋養(yǎng)細胞的侵襲和遷移能力,同時細胞中MMP-2的表達顯著增加;使用Angiogenin的si RNA轉(zhuǎn)染HTR8/SVneo發(fā)現(xiàn),通過si RNA降低Angiogenin表達后可以顯著抑制滋養(yǎng)細胞的侵襲和遷移能力,同時MMP-2表達減低;為了證實Angiogenin調(diào)控與MMP-2的相關(guān)性,我們使用MMP-2的si RNA設(shè)計了功能挽救實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn),降低MMP-2表達后可以明顯抑制Angiogenin對滋養(yǎng)細胞侵襲和遷移能力的促進作用。本部分研究結(jié)果提示,Angiogenin可以促進滋養(yǎng)細胞的侵襲和遷移功能,其調(diào)控作用依賴于MMP-2的表達。3.Angiogenin調(diào)控滋養(yǎng)細胞功能的mi RNA機制研究:為了進一步研究Angiogenin調(diào)控滋養(yǎng)細胞機制,我們對以往文獻中mi RNA芯片數(shù)據(jù)進行生物信息學分析和q PCR驗證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)細胞中差異表達的mi R-519d-3p可能參與了其調(diào)控;使用mi R-519d-3p mimics和inhibitor轉(zhuǎn)染后的Transwell實驗和劃痕實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),mi R-519d-3p可以明顯抑制滋養(yǎng)細胞的侵襲和遷移能力;使用mi R-519d-3p mimics和MMP-2 si RNA等進行熒光素酶報告基因?qū)嶒�、q PCR、Western blot實驗和功能學挽救實驗后證實,MMP-2 3’UTR區(qū)域存在一個mi R-519d-3p的結(jié)合位點,mi R-519d-3p可以抑制MMP-2的m RNA和蛋白表達,mi R-519d-3p通過抑制其靶基因MMP-2表達進而調(diào)控滋養(yǎng)細胞的侵襲和遷移功能;為了明確Angiogenin與mi R-519d-3p的相互調(diào)控關(guān)系及其在調(diào)控功能中的作用,我們對不同Angiogenin處理組中mi R-519d-3p表達譜進行分析,并使用Angiogenin si RNA和mi R-519d-3p inhibitor進行功能學挽救實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn),Angiogenin可以抑制mi R-519d-3p表達,其可以通過調(diào)控下游mi R-519d-3p/MMP-2信號通路進而參與滋養(yǎng)細胞的侵襲和遷移功能調(diào)控。4.Angiogenin、mi R-519d-5p和MMP-2在PE臨床樣本中的表達分析:為了證實Angiogenin/mi R-519d-3p/MMP-2調(diào)控通路在臨床滋養(yǎng)細胞相關(guān)疾病如PE發(fā)病中的作用,我們針對正�；颊吆蛃 PE患者胎盤組織中Angiogenin、mi R-519d-3p和MMP-2表達進行了q PCR檢測和Pearson相關(guān)系數(shù)及線性回歸分析。q PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正�；颊呦啾�,s PE患者胎盤中Angiogenin和MMP-2表達明顯降低,而mi R-519d-3p表達顯著升高;Pearson相關(guān)系數(shù)及線性回歸分析證實,s PE患者胎盤組織中Angiogenin、mi R-519d-3p和MMP-2表達明顯相關(guān),提示Angiogenin/mi R-519d-3p/MMP-2調(diào)控通路可能參與了臨床PE的發(fā)病過程。結(jié)論通過以上本課題研究結(jié)果,我們最終有以下幾點發(fā)現(xiàn):1.Angiogenin參與了滋養(yǎng)細胞侵襲和遷移功能的調(diào)控,它可以明顯促進滋養(yǎng)細胞的侵襲和遷移功能,其作用依賴于調(diào)控下游MMP-2表達;2.mi R-519d-3p可以抑制滋養(yǎng)細胞的侵襲和遷移能力,主要依賴于調(diào)控靶基因MMP-2而發(fā)揮抑制作用;3.Angiogenin通過mi R-519d-3p/MMP-2通路發(fā)揮促進滋養(yǎng)細胞侵襲和遷移功能的作用,同時Angiogenin/mi R-519d/MMP-2調(diào)控通路可能參與臨床PE的發(fā)病過程。
【關(guān)鍵詞】：Angiogenin 滋養(yǎng)細胞 侵襲 遷移 miR-519d-3p 子癇前期 基質(zhì)金屬蛋白酶-2
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R321.1
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-16
• 前言16-18
• 文獻回顧18-41
• 1 滋養(yǎng)細胞研究進展18-27
• 2 Angiogenin研究進展27-33
• 3 mi RNAs在胚胎發(fā)育中的作用33-40
• 4 總結(jié)40-41
• 第一部分 Angiogenin在不同處理組細胞和臨床樣本中的表達分析41-56
• 1 材料42-45
• 2 方法45-52
• 3 結(jié)果52-54
• 4 討論54-56
• 第二部分 Angiogenin對滋養(yǎng)細胞侵襲和遷移功能的影響56-75
• 1 材料56-58
• 2 方法58-69
• 3 結(jié)果69-73
• 4 討論73-75
• 第三部分 Angiogenin調(diào)控滋養(yǎng)細胞功能的mi RNA機制研究75-90
• 1 材料75-77
• 2 方法77-81
• 3 結(jié)果81-88
• 4 討論88-90
• 第四部分 Angiogenin、mi R-519d-5p和MMP-2 在PE臨床樣本中的表達分析90-96
• 1 材料90-91
• 2 方法91-92
• 3 結(jié)果92-94
• 4 討論94-96
• 小結(jié)96-97
• 參考文獻97-113
• 個人簡歷和研究成果113-114
• 致謝114

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 舒靜;田文琳;李林;劉玉林;陳俊霞;;下調(diào)血管生成素對人膀胱癌T24細胞增殖、凋亡的影響[J];第三軍醫(yī)大學學報;2014年14期

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中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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2 舒靜;下調(diào)血管生成素對膀胱癌T24細胞增殖及凋亡的影響及分子機制研究[D];重慶醫(yī)科大學;2014年

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本文編號：893608