本文關(guān)鍵詞：Angiogenin對滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移功能的影響及相關(guān)miRNA機(jī)制研究

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【摘要】：滋養(yǎng)細(xì)胞(trophoblast,TB)是構(gòu)成哺乳動物胎盤組織的重要功能細(xì)胞,在正常早期妊娠過程中,滋養(yǎng)細(xì)胞通過“節(jié)制性”的“生理侵襲”能力到達(dá)子宮肌層約1/3處的母體蛻膜組織,促使螺旋動脈重鑄、擴(kuò)張,進(jìn)而滿足正常生理妊娠過程中母胎間的營養(yǎng)供給和血液供應(yīng)。正常生理狀態(tài)下,滋養(yǎng)細(xì)胞的這種“生理性侵襲”具有明顯的時(shí)間性和空間性,即滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲功能僅發(fā)生在妊娠早期階段,在妊娠12周時(shí)達(dá)到高峰,然后逐漸減弱在妊娠14-20周時(shí)基本結(jié)束;同時(shí)滋養(yǎng)細(xì)胞僅侵襲到子宮肌層1/3處,而對深層組織無影響。病理狀態(tài)下,滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲功能異常將直接導(dǎo)致妊娠相關(guān)疾病的發(fā)生,如滋養(yǎng)細(xì)胞過度侵襲,破壞周圍組織會導(dǎo)致絨毛膜癌等腫瘤疾病的發(fā)生;而在子癇前期(preeclampsia,PE)發(fā)病過程中,由于多種因素共同作用導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞植入深度不足,進(jìn)而使螺旋動脈的植入和重鑄受到限制,最終導(dǎo)致流產(chǎn)、胎盤缺血、發(fā)育受限等。由此可見,滋養(yǎng)細(xì)胞的這種“生理性的侵襲功能”是受精卵的成功植入和胚胎發(fā)育的重要前提,但目前關(guān)于其侵襲功能的具體調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚。本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn),5%蛻膜基質(zhì)條件培養(yǎng)液(decidual stromal conditioned medium,DSCM)處理后的HTR-8/SVneo細(xì)胞侵襲和遷移能力明顯增強(qiáng),同時(shí)MMP-2表達(dá)水平和酶活性顯著增強(qiáng);而20%DSCM處理后HTR-8/SVneo細(xì)胞侵襲和遷移能力明顯減弱,MMP-2表達(dá)及酶活性顯著降低。隨后我們通過蛋白芯片比對不同處理組中差異表達(dá)的細(xì)胞因子后發(fā)現(xiàn),5%DSCM處理后的HTR8/SVneo細(xì)胞中angiogenin表達(dá)明顯增加,而20%DSCM處理后angiogenin表達(dá)顯著減低,angiogenin表達(dá)水平與滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力密切相關(guān),因此推測angiogenin可能對滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移功能發(fā)揮重要調(diào)控作用。目的及方法針對上述問題,在前期研究的基礎(chǔ)上,我們擬通過q PCR和Western blot方法明確Angiogenin在不同滋養(yǎng)細(xì)胞系和臨床樣本中的表達(dá);在構(gòu)建過表達(dá)質(zhì)粒和si RNA的基礎(chǔ)上,使用Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Angiogenin對滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移功能的調(diào)控作用;通過q PCR、Western blot、報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和功能挽救實(shí)驗(yàn)等方法闡明參與Angiogenin調(diào)控的可能mi RNA機(jī)制;通過對正�；颊吆蚉E患者臨床樣本中Angiogenin等相關(guān)因子的相關(guān)性分析進(jìn)一步論證Angiogenin及其相關(guān)mi RNA機(jī)制在PE發(fā)病中的作用。結(jié)果本課題研究結(jié)果可以分為以下4個(gè)部分,具體如下:1.Angiogenin在不同DSCM處理組細(xì)胞和臨床樣本中的表達(dá)分析:首先我們對芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行了q PCR驗(yàn)證,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與芯片結(jié)果一致,使用不同DSCM處理后滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移能力與細(xì)胞中Angiogenin的表達(dá)明顯相關(guān),具有較強(qiáng)侵襲能力的絨毛膜癌細(xì)胞JEG-3中Angiogenin表達(dá)明顯高于正常滋養(yǎng)細(xì)胞HTR8/SVneo,子癇前期患者胎盤組織中Angiogenin表達(dá)顯著低于正常妊娠患者。本部分研究結(jié)果提示Angiogenin可能參與了滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移功能調(diào)控。2.Angiogenin對滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移功能的影響:為了證實(shí)Angiogenin對滋養(yǎng)細(xì)胞功能的影響,我們首先設(shè)計(jì)并構(gòu)建了Angiogenin的過表達(dá)質(zhì)粒p CMV-ANG,通過質(zhì)粒測序和Western blot結(jié)果證實(shí)其構(gòu)建成功;使用p CMV-ANG過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR8/SVneo后,通過Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其可以明顯促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移能力,同時(shí)細(xì)胞中MMP-2的表達(dá)顯著增加;使用Angiogenin的si RNA轉(zhuǎn)染HTR8/SVneo發(fā)現(xiàn),通過si RNA降低Angiogenin表達(dá)后可以顯著抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移能力,同時(shí)MMP-2表達(dá)減低;為了證實(shí)Angiogenin調(diào)控與MMP-2的相關(guān)性,我們使用MMP-2的si RNA設(shè)計(jì)了功能挽救實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn),降低MMP-2表達(dá)后可以明顯抑制Angiogenin對滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移能力的促進(jìn)作用。本部分研究結(jié)果提示,Angiogenin可以促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移功能,其調(diào)控作用依賴于MMP-2的表達(dá)。3.Angiogenin調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞功能的mi RNA機(jī)制研究:為了進(jìn)一步研究Angiogenin調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞機(jī)制,我們對以往文獻(xiàn)中mi RNA芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析和q PCR驗(yàn)證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)細(xì)胞中差異表達(dá)的mi R-519d-3p可能參與了其調(diào)控;使用mi R-519d-3p mimics和inhibitor轉(zhuǎn)染后的Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),mi R-519d-3p可以明顯抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移能力;使用mi R-519d-3p mimics和MMP-2 si RNA等進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、q PCR、Western blot實(shí)驗(yàn)和功能學(xué)挽救實(shí)驗(yàn)后證實(shí),MMP-2 3’UTR區(qū)域存在一個(gè)mi R-519d-3p的結(jié)合位點(diǎn),mi R-519d-3p可以抑制MMP-2的m RNA和蛋白表達(dá),mi R-519d-3p通過抑制其靶基因MMP-2表達(dá)進(jìn)而調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移功能;為了明確Angiogenin與mi R-519d-3p的相互調(diào)控關(guān)系及其在調(diào)控功能中的作用,我們對不同Angiogenin處理組中mi R-519d-3p表達(dá)譜進(jìn)行分析,并使用Angiogenin si RNA和mi R-519d-3p inhibitor進(jìn)行功能學(xué)挽救實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn),Angiogenin可以抑制mi R-519d-3p表達(dá),其可以通過調(diào)控下游mi R-519d-3p/MMP-2信號通路進(jìn)而參與滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移功能調(diào)控。4.Angiogenin、mi R-519d-5p和MMP-2在PE臨床樣本中的表達(dá)分析:為了證實(shí)Angiogenin/mi R-519d-3p/MMP-2調(diào)控通路在臨床滋養(yǎng)細(xì)胞相關(guān)疾病如PE發(fā)病中的作用,我們針對正�；颊吆蛃 PE患者胎盤組織中Angiogenin、mi R-519d-3p和MMP-2表達(dá)進(jìn)行了q PCR檢測和Pearson相關(guān)系數(shù)及線性回歸分析。q PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正�；颊呦啾�,s PE患者胎盤中Angiogenin和MMP-2表達(dá)明顯降低,而mi R-519d-3p表達(dá)顯著升高;Pearson相關(guān)系數(shù)及線性回歸分析證實(shí),s PE患者胎盤組織中Angiogenin、mi R-519d-3p和MMP-2表達(dá)明顯相關(guān),提示Angiogenin/mi R-519d-3p/MMP-2調(diào)控通路可能參與了臨床PE的發(fā)病過程。結(jié)論通過以上本課題研究結(jié)果,我們最終有以下幾點(diǎn)發(fā)現(xiàn):1.Angiogenin參與了滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移功能的調(diào)控,它可以明顯促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移功能,其作用依賴于調(diào)控下游MMP-2表達(dá);2.mi R-519d-3p可以抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移能力,主要依賴于調(diào)控靶基因MMP-2而發(fā)揮抑制作用;3.Angiogenin通過mi R-519d-3p/MMP-2通路發(fā)揮促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移功能的作用,同時(shí)Angiogenin/mi R-519d/MMP-2調(diào)控通路可能參與臨床PE的發(fā)病過程。
【關(guān)鍵詞】：Angiogenin 滋養(yǎng)細(xì)胞 侵襲 遷移 miR-519d-3p 子癇前期 基質(zhì)金屬蛋白酶-2
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R321.1
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-16
• 前言16-18
• 文獻(xiàn)回顧18-41
• 1 滋養(yǎng)細(xì)胞研究進(jìn)展18-27
• 2 Angiogenin研究進(jìn)展27-33
• 3 mi RNAs在胚胎發(fā)育中的作用33-40
• 4 總結(jié)40-41
• 第一部分 Angiogenin在不同處理組細(xì)胞和臨床樣本中的表達(dá)分析41-56
• 1 材料42-45
• 2 方法45-52
• 3 結(jié)果52-54
• 4 討論54-56
• 第二部分 Angiogenin對滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移功能的影響56-75
• 1 材料56-58
• 2 方法58-69
• 3 結(jié)果69-73
• 4 討論73-75
• 第三部分 Angiogenin調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞功能的mi RNA機(jī)制研究75-90
• 1 材料75-77
• 2 方法77-81
• 3 結(jié)果81-88
• 4 討論88-90
• 第四部分 Angiogenin、mi R-519d-5p和MMP-2 在PE臨床樣本中的表達(dá)分析90-96
• 1 材料90-91
• 2 方法91-92
• 3 結(jié)果92-94
• 4 討論94-96
• 小結(jié)96-97
• 參考文獻(xiàn)97-113
• 個(gè)人簡歷和研究成果113-114
• 致謝114

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 舒靜;田文琳;李林;劉玉林;陳俊霞;;下調(diào)血管生成素對人膀胱癌T24細(xì)胞增殖、凋亡的影響[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2014年14期

2 Hongli Wang;Dongsheng Fan;Yingshuang Zhang;;Angiogenin gene polymorphism A risk factor for diabetic peripheral neuropathy in the northern Chinese Han population?[J];Neural Regeneration Research;2013年36期

3 高燕;盛靜浩;許正平;;血管生成素:RNA代謝過程中重要的核糖核酸酶[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2014年04期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 盛靜浩;血管生成素和核糖核酸酶-4基因表達(dá)調(diào)控及其生物學(xué)功能研究[D];浙江大學(xué);2013年

2 董豪杰;血管生成素對miR-141的調(diào)控作用及其在血管生成中的功能[D];浙江大學(xué);2014年

3 翟yN星;斑馬魚核糖核酸酶1和5在胚胎發(fā)育早期的功能研究[D];浙江大學(xué);2015年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 堵芳;糖尿病及伴有不穩(wěn)定型心絞痛患者血清中血管生成因子濃度的變化[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2013年

2 舒靜;下調(diào)血管生成素對膀胱癌T24細(xì)胞增殖及凋亡的影響及分子機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2014年

3 鐘婷;神經(jīng)病靶酯酶在子癇前期疾病發(fā)生中的作用及其機(jī)制的研究[D];南昌大學(xué);2014年

4 高燕;血管生成素在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平及其臨床意義分析[D];浙江大學(xué);2014年

5 徐祥;堿性成纖維細(xì)胞生長因子對大鼠急性創(chuàng)面血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、血管生成素-1表達(dá)的影響[D];皖南醫(yī)學(xué)院;2014年

6 梁運(yùn)鵬;翼手目核糖核酸酶5基因（RNase5）的分子進(jìn)化研究[D];云南大學(xué);2015年

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本文編號：893608