發(fā)布時(shí)間：2017-09-20 17:06

  本文關(guān)鍵詞：國產(chǎn)多孔鉭對成骨生物學(xué)效應(yīng)影響機(jī)制的體外研究

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【摘要】：第一章國產(chǎn)多孔鉭對兔成骨細(xì)胞生物學(xué)行為及功能影響的研究目的：通過對國產(chǎn)多孔鉭支架材料的物理特性、與成骨細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)后成骨細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、成骨性細(xì)胞因子分泌功能影響的研究,探討國產(chǎn)多孔鉭支架材料的生物相容性及在修復(fù)骨缺損、骨再生中的作用,為進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：掃描電鏡觀察國產(chǎn)多孔鉭支架材料表面和內(nèi)部的形貌特征。取新生乳兔顱蓋骨成骨細(xì)胞進(jìn)行分離、培養(yǎng)及鑒定,以DMEM為浸提介質(zhì)根據(jù)國標(biāo)ISO10993-5/ISO 10993-12制備鉭浸提液,將多孔鉭支架材料高溫高壓滅菌。隨機(jī)取第3代成骨細(xì)胞分為三組,A組為單純成骨細(xì)胞培養(yǎng)組,B組為多孔鉭浸提液與成骨細(xì)胞培養(yǎng)組,C組為多孔鉭支架材料與成骨細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)組。CCK-8法檢測三組成骨細(xì)胞生長增殖情況,檢測多孔鉭支架材料對細(xì)胞毒性及增殖的影響。倒置相差顯微鏡、掃描電鏡、透射電鏡觀察成骨細(xì)胞在多孔鉭支架材料上的形態(tài)結(jié)構(gòu),生長、粘附、增殖情況。流式細(xì)胞儀檢測多孔鉭支架材料上生長的成骨細(xì)胞的細(xì)胞周期。采用ELISA試劑盒,檢測三組成骨細(xì)胞培養(yǎng)后3、5、7天骨鈣素與一型膠原的分泌。結(jié)果：國產(chǎn)多孔鉭支架材料表面及斷面可見針尖大小,分布均勻的蜂窩狀孔隙。掃描電鏡下觀察可見支架材料表面與斷面上分布直徑20-50μm的微粒,微粒間存在直徑400-600μm的孔隙,孔隙間相互連通呈網(wǎng)狀,類似于骨松質(zhì)構(gòu)架。CCK-8法檢測結(jié)果：隨培養(yǎng)時(shí)間的延長,三組成骨細(xì)胞生長狀態(tài)良好,無明顯差異,成骨細(xì)胞形態(tài)正常,貼壁增殖良好,發(fā)現(xiàn)各組各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。倒置相差顯微鏡觀察成骨細(xì)胞與多孔鉭支架材料復(fù)合培養(yǎng)可見多孔鉭支架材料邊緣粘附大量成骨細(xì)胞；掃描電鏡觀察可見成骨細(xì)胞在多孔鉭支架材料表面及內(nèi)部孔隙內(nèi)生長、粘附、增殖,形態(tài)多樣,細(xì)胞相互連接,并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì),基質(zhì)連接呈片狀,逐步覆蓋材料；透射電鏡觀察可見成骨細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)大小形態(tài)正常,無明顯變化。細(xì)胞周期檢測結(jié)果提示三組細(xì)胞均為正常二倍體細(xì)胞,三組細(xì)胞周期分布相似,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。隨機(jī)抽取各時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞進(jìn)行分泌功能的檢測,結(jié)果顯示三組細(xì)胞均有骨鈣素與I型膠原的分泌。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨培養(yǎng)時(shí)間延長,細(xì)胞骨鈣素分泌逐漸增多。多孔鉭支架組骨鈣素分泌較其他兩組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；鉭浸提液組與正常培養(yǎng)液組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。各組Ⅰ型膠原分泌結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)初期隨時(shí)間增加I型膠原分泌量增多,5d出現(xiàn)高峰,之后開始下降,同一時(shí)間點(diǎn)三組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；各組組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)比較,結(jié)果顯示三組不同時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；多重比較顯示除多孔鉭支架組組內(nèi)3d和7d無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),其余組間比較均有統(tǒng)計(jì)差異(P0.05)。結(jié)論：國產(chǎn)多孔鉭支架材料具備良好的生物相容性；成骨細(xì)胞與多孔鉭支架復(fù)合培養(yǎng)后骨鈣素分泌增多,提示多孔鉭支架材料可能促進(jìn)成骨細(xì)胞的礦化及成骨作用。第二章國產(chǎn)多孔鉭對成骨因子及成骨轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)影響的研究目的：通過檢測成骨細(xì)胞與國產(chǎn)多孔鉭支架材料復(fù)合培養(yǎng)后的成骨因子骨鈣素、Ⅰ型膠原、骨橋蛋白、纖維粘連蛋白以及成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx-2、OSX、P38MAPK的表達(dá)變化情況,探討國產(chǎn)多孔鉭支架材料對成骨細(xì)胞的成骨效應(yīng)影響的作用機(jī)制,為國產(chǎn)多孔鉭支架材料的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。方法：隨機(jī)取第3代成骨細(xì)胞分為三組,A組為單純成骨細(xì)胞培養(yǎng)組(正常培養(yǎng)液組),B組為多孔鉭浸提液與成骨細(xì)胞培養(yǎng)組,C組為多孔鉭支架材料與成骨細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)組。分別取培養(yǎng)5d的三組細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞爬片,采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法測定成骨因子Col-1、OC、FN、OPN及成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx-2、OSX、 P38MAPK的表達(dá)情況；并對多孔鉭支架組細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞熒光化學(xué)染色法檢測成骨因子OPN與成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx-2、OSX, P38 MAPK與Runx-2、OSX的共表達(dá)情況。分別提取培養(yǎng)5d的三組細(xì)胞的蛋白及RNA分別采用免疫細(xì)胞蛋白印跡法及實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測Col-1、OC、FN、OPN及Runx-2、 OSX、 P38MAPK蛋白及mRNA表達(dá)情況。結(jié)果：免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測培養(yǎng)5d的各組細(xì)胞成骨因子表達(dá)情況發(fā)現(xiàn),在正常培養(yǎng)液組、鉭浸提液組及多孔鉭支架組均存在OC、Col-1、FN、OPN、 Runx-2、OSX、p-P38(磷酸化的P38)的陽性細(xì)胞的表達(dá),細(xì)胞胞漿內(nèi)可見棕黃色顆粒,多孔鉭支架組各因子的表達(dá)均較其他兩組有升高趨勢,尤其是OC、OPN、 Runx-2、OSX的表達(dá)較其他兩組顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)多孔鉭支架組存在Runx-2、OSX分別與OPN共表達(dá)情況,通過熒光染劑標(biāo)記Funx-2、OSX在細(xì)胞胞漿內(nèi)呈綠色,OPN呈紅色,多孔鉭支架組的成骨細(xì)胞中存在Ri nx-2、OSX分別與OPN共表達(dá)的情況,胞漿呈黃綠色；同時(shí)還可見p-P38熒光染色為紅色,同時(shí)分別標(biāo)記Runx-2、OSX綠色后可與p-P38熒光雙標(biāo),發(fā)現(xiàn)還存在p-P38分別與Runx-2、OSX的共表達(dá),胞漿呈黃綠色的情況。免疫細(xì)胞蛋白印跡結(jié)果發(fā)現(xiàn)三組細(xì)胞各因子蛋白表達(dá)情況與免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果基本一致,三組均存在OC、Col-1、FN、OPN、Runx-2、OSX、p-P38的蛋白表達(dá),多孔鉭支架組OC、OPN、Runx-2、OSX蛋白表達(dá)顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測導(dǎo)各組均存在OC、Col-1、 FN、OPN、Runx-2、OSX、p-P38 mRNA的表達(dá),多孔鉭支架組OC、OPN、Runx-2、OSX基因相對表達(dá)量顯著上調(diào),與其他兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論：國產(chǎn)多孔鉭支架材料可通過影響成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx-2、OSX的表達(dá),影響成骨因子Col-1、OPN、OC、FN表達(dá)最終促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、生長與礦化,促進(jìn)成骨,是較理想的骨移植替代材料。第三章國產(chǎn)多孔鉭與成骨細(xì)胞相互作用機(jī)制的蛋白質(zhì)組學(xué)研究目的：采用以同位素相對標(biāo)記與絕對定量技術(shù)(iTRAQ)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析MG63細(xì)胞在正常培養(yǎng)液、鉭浸提液以及多孔鉭支架材料,三種不同的培養(yǎng)環(huán)境下蛋白表達(dá)的改變,查找并探討分析多孔鉭支架材料的三維立體結(jié)構(gòu)對成骨細(xì)胞影響的相關(guān)因子及其作用機(jī)制,同時(shí)對前期工作進(jìn)行印證。方法：取生長狀態(tài)良好的第3代MG63細(xì)胞,隨機(jī)分為三組,A組為正常培養(yǎng)液組,B組為鉭浸提液組,C組為多孔鉭支架材料組。每組接種相同數(shù)量的MG63細(xì)胞。A組MG63細(xì)胞采用MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；B組MG63細(xì)胞采用鉭浸提液培養(yǎng);C組取高溫高壓滅菌的多孔鉭支架材料,MEM培養(yǎng)液浸潤后將MG63細(xì)胞懸液滴到多孔鉭支架材料表面,在37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)2h,將材料翻轉(zhuǎn),滴加MG63細(xì)胞懸液25μl于材料的另一面,在37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)2h,將支架材料移入一新孔內(nèi),加入MEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。三組培養(yǎng)板于37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),每2d更換1次培養(yǎng)液,連續(xù)培養(yǎng)7天。CCK-8法檢測細(xì)胞增值情況。掃描電鏡觀察多孔鉭支架上細(xì)胞生長狀態(tài)。提取各組細(xì)胞蛋白,采用Bradford法蛋白定量,提取部分蛋白進(jìn)行雙向熒光凝膠差異電泳,檢查蛋白提取及定量情況以及三樣本間差異狀況,初步分析蛋白樣本情況。采用iTRAQ試劑將A、B、C組剩余細(xì)胞蛋白樣品標(biāo)記,酶解肽段離線預(yù)分離,LC-MS/MS質(zhì)譜分析,經(jīng)過強(qiáng)陽離子交換、反相液相色譜分離后采用ABI-5600質(zhì)譜進(jìn)行質(zhì)譜分析,對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,對蛋白進(jìn)行檢測和鑒定,將差異蛋白篩選完成。通過總體差異蛋白的處理,篩選參與影響成骨細(xì)胞的差異蛋白。對差異蛋白定量信息統(tǒng)計(jì),對數(shù)據(jù)的生物信息解析。對差異蛋白進(jìn)行分子功能、亞細(xì)胞定位、參與的生物過程的GO分析,尋找與差異蛋白顯著相關(guān)的生物學(xué)功能,完成蛋白質(zhì)之間的相互作用的分析,探討多孔鉭支架材料組與鉭浸提液組以及正常培養(yǎng)液組差異蛋白參與的主要的生物代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。結(jié)果：MG63細(xì)胞在正常培養(yǎng)液、鉭浸提液以及多孔鉭支架材料三種環(huán)境下培養(yǎng),細(xì)胞生長狀態(tài)良好,細(xì)胞形態(tài)單一化,呈多角形或長梭形；ALP染色結(jié)果陽性。經(jīng)析因方差分析不同時(shí)間下正常培養(yǎng)液組、鉭浸提液組和多孔鉭支架組CCK-8法檢測細(xì)胞活性O(shè)D值的結(jié)果。組間OD值差異無顯著性意義(F=2.141,P=0.124)。不同時(shí)間間差異有顯著性意義(F=2302.523,P0.001)。分組和時(shí)間之間存在交互作用(F=4.661,P0.001)。單獨(dú)效應(yīng)：固定時(shí)間進(jìn)行組間比較,結(jié)果顯示除7d外其余時(shí)間三組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。掃描電鏡觀察,多孔鉭支架材料組細(xì)胞在材料表面以及材料孔隙間粘附生長,初期細(xì)胞排列較稀疏；隨時(shí)間增加相鄰細(xì)胞互相連接,逐步覆蓋大部分材料表面,并延伸入孔隙當(dāng)中；后期細(xì)胞分泌大量基質(zhì),逐步覆蓋材料表面。提取三組細(xì)胞蛋白進(jìn)行定量分析,凝膠電泳結(jié)果提示三組樣本條帶清晰、多根、分布均勻、無明顯高豐度,符合進(jìn)行試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)。雙向熒光差異電泳發(fā)現(xiàn)三樣本間存在明顯的差異點(diǎn),達(dá)到iTRAQ試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)。iTRAQ實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)原始數(shù)據(jù)的p-value,選取p≤0.05進(jìn)行過濾后,差異倍數(shù)≥1.5或差異倍數(shù)≤0.666,所得結(jié)果進(jìn)入分析,鑒定到鉭浸提液組與正常培養(yǎng)液組比較差異蛋白有56個(gè)；多孔鉭支架材料組與正常培養(yǎng)液組比較差異蛋白有150個(gè)。將差異蛋白數(shù)據(jù)Map到DAVID的數(shù)據(jù)庫中,鉭浸提液組與正常培養(yǎng)液組比較差異,有6個(gè)不能識別,數(shù)據(jù)庫識別有記錄信息的有50個(gè),其中上調(diào)蛋白35個(gè),下調(diào)蛋白15個(gè),開展GO功能注釋,通過對差異蛋白參與的生物學(xué)過程、具備的分子功能以及蛋白質(zhì)所屬細(xì)胞成分的分析,篩選出與本實(shí)驗(yàn)相關(guān)的差異蛋白上調(diào)蛋白6個(gè),下調(diào)蛋白2個(gè)；多孔鉭支架材料組與正常培養(yǎng)液組差異比較蛋白,有26個(gè)不能識別,數(shù)據(jù)庫識別有記錄信息的有124個(gè),其中上調(diào)蛋白104個(gè),下調(diào)蛋白20個(gè),開展GO功能注釋,通過對差異蛋白參與的生物學(xué)過程、具備的分子功能以及蛋白質(zhì)所屬細(xì)胞成分的分析,篩選出與本實(shí)驗(yàn)相關(guān)的差異蛋白上調(diào)蛋白12個(gè),下調(diào)蛋白1個(gè)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)驅(qū)動(dòng)蛋白-1,肌動(dòng)蛋白,角蛋白10具有一致性差異表達(dá)；多孔鉭支架材料組出現(xiàn)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白,凝溶膠,過氧化氫酶,磷脂酶A2,整合素β-1,鈣結(jié)合蛋白A4,細(xì)胞外基質(zhì)蛋白-1的差異上調(diào)。結(jié)論：經(jīng)過同位素相對標(biāo)記與絕對定量技術(shù)(iTRAQ),篩選出多孔鉭支架組與鉭浸提液組以及正常培養(yǎng)液組的差異蛋白,驗(yàn)證前期工作的同時(shí),揭示多孔鉭材料與細(xì)胞相互作用機(jī)制,前期工作提示細(xì)胞在多孔鉭的三維立體結(jié)構(gòu)上細(xì)胞增殖,粘附能力增強(qiáng),細(xì)胞基質(zhì)分泌增多,通過蛋白組學(xué)技術(shù)分析多孔鉭支架材料組出現(xiàn)的大部分差異蛋白主要參與細(xì)胞粘附、運(yùn)動(dòng)、分泌過程,說明多孔鉭的三維立體空間結(jié)構(gòu)、高孔隙率和內(nèi)部微孔結(jié)構(gòu)可增強(qiáng)細(xì)胞粘附、分泌的能力,進(jìn)一步為國產(chǎn)多孔鉭支架材料的研究提供理論基礎(chǔ)和新的研究方向。
【關(guān)鍵詞】：國產(chǎn)多孔鉭支架材料 細(xì)胞毒性 生物相容性 成骨細(xì)胞 細(xì)胞外基質(zhì) 國產(chǎn)多孔鉭支架 骨鈣素 骨橋蛋白 Runx-2 OSX 國產(chǎn)多孔鉭 支架材料 蛋白質(zhì)組學(xué) iTRAQ
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R68;R318.08
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 前言19-26
• 參考文獻(xiàn)22-26
• 第一章 國產(chǎn)多孔鉭對兔成骨細(xì)胞生物學(xué)行為及功能影響的研究26-58
• 1.1 儀器與試劑27-29
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法29-34
• 1.3 試驗(yàn)結(jié)果34-49
• 1.4 討論49-53
• 1.5 參考文獻(xiàn)53-58
• 第二章 國產(chǎn)多孔鉭對成骨因子及成骨相關(guān)因子表達(dá)影響的研究58-93
• 2.1 儀器與試劑60-62
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法62-68
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果68-84
• 2.4 討論84-88
• 2.5 參考文獻(xiàn)88-93
• 第三章 國產(chǎn)多孔鉭與成骨細(xì)胞相互作用機(jī)制的蛋白質(zhì)組學(xué)研究93-131
• 3.1 儀器與試劑95-99
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法99-105
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果105-119
• 3.4 討論119-125
• 3.5 參考文獻(xiàn)125-131
• 小結(jié)131-132
• 本課題創(chuàng)新點(diǎn)131
• 本課題不足點(diǎn)131-132
• 成果132-133
• 致謝133-135
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)證明135

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本文編號：889303