本文關(guān)鍵詞：人類弱精子癥精子的容積調(diào)節(jié)能力、運(yùn)動(dòng)能力和氯通道的表達(dá)

  更多相關(guān)文章： 弱精子癥 細(xì)胞容積調(diào)節(jié) ClC-3氯通道 精子運(yùn)動(dòng)

【摘要】：目的:闡明調(diào)節(jié)精子功能的機(jī)制是診斷和治療男性不育、開發(fā)新型男性避孕手段的先決條件。容積調(diào)節(jié)能力對(duì)于精子的生理功能至關(guān)重要,容積敏感性氯通道是決定精子調(diào)節(jié)能力的關(guān)鍵因素之一,參與健康精子細(xì)胞在低滲環(huán)境中的容積調(diào)節(jié)過程。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,不育小鼠精子的容積調(diào)節(jié)能力明顯降低。然而人類弱精子的容積調(diào)節(jié)能力以及氯通道的表達(dá)情況尚不清楚。本研究旨在研究人類弱精子癥精子在低滲環(huán)境中的容積調(diào)節(jié)能力,以及氯通道在精子容積調(diào)節(jié)和運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮的作用,并探討容積敏感性氯通道在弱精子的表達(dá)及其在運(yùn)動(dòng)中的作用,為臨床治療男性不育以及開發(fā)離子通道型男性避孕藥提供理論依據(jù)。方法:1)根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)出版的《人類精液檢驗(yàn)與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(第五版)》中實(shí)驗(yàn)方法,采用計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)(CASA)進(jìn)行精液常規(guī)分析;2)正常精子和弱精子精液樣本均由廣東省計(jì)劃生育�？漆t(yī)院男性實(shí)驗(yàn)室和人類精子庫提供;3)用計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)(CASA)檢測(cè)精子的各項(xiàng)運(yùn)動(dòng)參數(shù),如精子的前向運(yùn)動(dòng)(PR)百分比、直線運(yùn)動(dòng)速率(VSL)、曲線運(yùn)動(dòng)速率(VCL)、平均路徑速率(VAP);4)根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到的前向散射信號(hào)來反映精子的容積變化;5)用激光共聚焦免疫熒光技術(shù)檢測(cè)氯通道在精子上的表達(dá)與定位,并用流式細(xì)胞術(shù)分析精子氯通道的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果:在等滲液(BWW330)中,正常精子細(xì)胞容積維持穩(wěn)定,改用低滲液(BWW290)孵育,正常人的精子容積幾乎沒有變化(P0.05),表明正常精子在低滲環(huán)境中能夠有效地調(diào)節(jié)自身的容積,恢復(fù)細(xì)胞的正常大小。然而弱精子在低滲液中的容積明顯變大(P0.01),表明在低滲環(huán)境下,弱精子不能有效地調(diào)節(jié)自身的容積。提示弱精子的容積調(diào)節(jié)機(jī)制異常,導(dǎo)致容積調(diào)節(jié)能力減弱。氯通道阻斷劑5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)benzoic acid NPPB(100mmol/L)和4,4'-Diisothiocyano-2,2'-stilbenedisulfonic acid DIDS(100mmol/L)均可以顯著地抑制正常精子在低滲環(huán)境中的調(diào)節(jié)性容積回縮能力(P0.01),導(dǎo)致正常精子的容積增大;而對(duì)弱精子的容積幾乎沒有影響(P0.05),表明弱精子對(duì)氯通道阻斷劑不敏感,提示弱精子的氯通道表達(dá)(表達(dá)量或類型)異常。細(xì)胞外滲透壓從330 m Osm/kg降低到290 m Osm/kg時(shí),正常精子的多項(xiàng)運(yùn)動(dòng)參數(shù)如前向運(yùn)動(dòng)(PR)百分比、直線運(yùn)動(dòng)速率(VSL)、曲線運(yùn)動(dòng)速率(VCL)、平均路徑速率(VAP)的數(shù)值均明顯增加,表明正常精子在低滲液中的的運(yùn)動(dòng)明顯增強(qiáng),而弱精子動(dòng)參數(shù)如前向運(yùn)動(dòng)(PR)百分比、直線運(yùn)動(dòng)速率(VSL)、曲線運(yùn)動(dòng)速率(VCL)、平均路徑速率(VAP)的數(shù)值均明顯減小,表明弱精子在低滲液中的運(yùn)動(dòng)則顯著減弱。NPPB和DIDS在等滲液(BWW330)和低滲液(BWW290)中均明顯抑制正常精子和弱精子的運(yùn)動(dòng),其中DIDS的抑制作用比NPPB更強(qiáng),NPPB在BWW290中對(duì)正常精子運(yùn)動(dòng)的抑制作用大于弱精子。結(jié)果提示氯通道的激活在精子運(yùn)動(dòng)過程中起重要作用。流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果顯示,弱精子Cl C-3氯通道蛋白的表達(dá)量明顯低于正常精子。進(jìn)一步用激光共聚焦免疫熒光技術(shù)定位分析Cl C-3氯通道在精子細(xì)胞中的分布,結(jié)果顯示,Cl C-3氯通道蛋白在正常精子和弱精子的頸部及尾部均有表達(dá),但弱精子頸部Cl C-3的表達(dá)明顯弱于正常精子細(xì)胞(P0.01)。用免疫熒光技術(shù),在正常精子和弱精子細(xì)胞中均檢測(cè)不到Cl C-5和Cl C-7氯通道的表達(dá)。結(jié)論:1)弱精子在低滲環(huán)境下的容積調(diào)節(jié)能力明顯弱于正常精子,氯通道在精子的容積調(diào)節(jié)過程中起重要作用;2)低滲刺激可以促進(jìn)正常精子的運(yùn)動(dòng),但弱精子在低滲環(huán)境中的運(yùn)動(dòng)能力明顯降低;3)氯通道是調(diào)節(jié)精子運(yùn)動(dòng)能力重要因素;4)容積敏感性氯通道Cl C-3在正常精子的表達(dá)明顯強(qiáng)于弱精子,尤其是在精子頸部的表達(dá),提示精子頸部氯通道的激活可能是調(diào)節(jié)精子運(yùn)動(dòng)的關(guān)鍵因素。
【關(guān)鍵詞】：弱精子癥 細(xì)胞容積調(diào)節(jié) ClC-3氯通道 精子運(yùn)動(dòng)
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R698.2
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 1 前言11-26
• 1.1 精子的運(yùn)動(dòng)11-14
• 1.1.1 影響精子運(yùn)動(dòng)的因素11-13
• 1.1.2 精子運(yùn)動(dòng)功能的主要檢測(cè)方法13-14
• 1.2 弱精子癥14-18
• 1.2.1 病因14-18
• 1.2.2 弱精子癥的診斷18
• 1.3 細(xì)胞的容積調(diào)節(jié)功能18-22
• 1.3.1 體細(xì)胞的容積調(diào)節(jié)功能18-20
• 1.3.2 精子細(xì)胞的容積調(diào)節(jié)功能20-22
• 1.4 細(xì)胞容積的測(cè)量22-24
• 1.5 研究目的24-25
• 1.6 研究意義25-26
• 2 實(shí)驗(yàn)材料與方法26-37
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料26-29
• 2.1.1 臨床精液樣本的收集與處理26-28
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器28-29
• 2.2 常用液體和試劑的配制29-31
• 2.3 精子形態(tài)的觀察31
• 2.4 精子細(xì)胞的孵育31
• 2.5 流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)檢測(cè)精子細(xì)胞的容積31-32
• 2.6 精子胞質(zhì)小滴的觀察32-33
• 2.7 計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)（CASA）檢測(cè)精子的運(yùn)動(dòng)情況33-35
• 2.8 免疫熒光技術(shù)檢測(cè) ClC 通道在人類精子上表達(dá)與定位35
• 2.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ClC-3 蛋白在正常精子與弱精子中的表達(dá)35-36
• 2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法36-37
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-61
• 3.1 精子的形態(tài)37-38
• 3.2 精子細(xì)胞的容積調(diào)節(jié)38-41
• 3.2.1 低滲刺激下精子的容積調(diào)節(jié)能力38-39
• 3.2.2 氯通道阻斷劑對(duì)精子容積調(diào)節(jié)的影響39-41
• 3.2.2.1 NPPB對(duì)精子容積調(diào)節(jié)的影響39-40
• 3.2.2.2 DIDS對(duì)精子容積調(diào)節(jié)的影響40-41
• 3.2.2.3 不同滲透壓氯通道阻斷劑對(duì)精子存活率的影響41
• 3.3 精子胞質(zhì)小滴(CDS)的觀察41-42
• 3.4 計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)（CASA）檢測(cè)精子運(yùn)動(dòng)能力的變化42-55
• 3.4.1 正常精子和弱精子在不同滲透壓環(huán)境中運(yùn)動(dòng)能力的改變42-45
• 3.4.2 氯通道阻斷劑對(duì)等滲環(huán)境中正常精子和弱精子運(yùn)動(dòng)能力的抑制作用45-50
• 3.4.2.1 NPPB 對(duì)等滲液體中正常精子和弱精子運(yùn)動(dòng)的抑制作用45-47
• 3.4.2.2 DIDS 對(duì)等滲液體中正常精子和弱精子運(yùn)動(dòng)的抑制作用47-50
• 3.4.3 氯通道阻斷劑對(duì)低滲刺激下正常精子和弱精子運(yùn)動(dòng)能力的抑制作用50-55
• 3.5 正常精子和弱精子細(xì)胞上 ClC 氯通道的表達(dá)與定位55-61
• 3.5.1 ClC-3 氯通道在正常和弱精子上的定位情況55
• 3.5.2 ClC-3 蛋白在正常精子和弱精子頸部的表達(dá)55-58
• 3.5.3 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè) ClC-3 氯通道蛋白在正常精子和弱精子上的表達(dá)58-59
• 3.5.4 ClC-5 和 ClC-7 氯通道在正常和弱精子上的表達(dá)情況59-61
• 討論61-65
• 結(jié)論65-66
• 總結(jié)與展望66-67
• 參考文獻(xiàn)67-76
• 在校期間科研情況76-77
• 附錄 中英文縮略詞表77-78
• 致謝78

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