本文關(guān)鍵詞：含硫酸腦苷脂的靶向乳腺癌載紫杉醇液態(tài)氟碳納米微球的制備和評價(jià)

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【摘要】：一.研究背景惡性腫瘤的治療是當(dāng)今生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的難題。在婦女中高發(fā)病率的乳腺癌,是全球重要的健康問題,特別是在低收入和中等收入水平的國家更是如此。紫杉醇(Paclitaxel, PTX)是從短葉紅豆杉的樹皮中提取分離的抗腫瘤藥物,是臨床上治療乳腺癌的有效抗癌藥物。紫杉醇溶解度極低,因此,臨床上將其溶解于聚氧乙烯蓖麻油和無水乙醇(50：50,v/v)中使用。然而聚氧乙烯蓖麻油在體內(nèi)代謝釋放的組織胺,會(huì)發(fā)生較嚴(yán)重的過敏反應(yīng)。紫杉醇本身也因?yàn)槿狈Π薪M織的選擇性,所以有諸如骨髓抑制、血小板減少、白細(xì)胞減少、貧血等全身性毒副作用。聚氧乙烯蓖麻油代謝物產(chǎn)生的副作用和無選擇性的全身毒副作用,大大限制了紫杉醇的臨床應(yīng)用。因此,利用載體包載紫杉醇是提高藥效、減少毒害作用和提高生物利用度的有效途徑與方法。液態(tài)氟碳納米微球(perfluooctylbromide nanoparticles, NPs)是由脂質(zhì)單分子層包裹液態(tài)氟碳(perfluooctylbromide, PFOB)組成。據(jù)報(bào)道NPs安全性好,作為血液代替品在臨床使用。NPs作為新一代的納米超聲造影劑研究時(shí),發(fā)現(xiàn)其作為藥物載體同樣具有優(yōu)勢。靶向性的納米微球藥物傳遞系統(tǒng),是近年來興起的技術(shù),其作為藥物傳遞系統(tǒng)的潛力近年來越來越受到重視。乳腺癌、卵巢癌等癌細(xì)胞比其它正常細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生的糖蛋白更高,硫酸腦苷脂(sulfatide)可以與細(xì)胞或細(xì)胞基質(zhì)外的糖蛋白,特別是和肌糖蛋白(Tenascin-C, TN-C)相結(jié)合。因此,sulfatide可以作為靶向乳腺癌的靶向配體。本文將sulfatide和NPs連接起來作為PTX的給藥系統(tǒng)(sulfatide-perfluooctylbromide nanoparticles,SNPs)靶向乳腺癌進(jìn)行治療。目前多數(shù)靶向型NPs都是以克隆抗體作為靶向材料,克隆抗體本身因?yàn)榫哂忻庖咴�、在體內(nèi)穩(wěn)定性差以及操作復(fù)雜等缺點(diǎn),大大限制了靶向顯像和給藥的進(jìn)一步發(fā)展。Sulfatide作為靶向材料,具有穩(wěn)定性強(qiáng),容易操作的優(yōu)點(diǎn)。最重要的是它不僅可以作為靶向材料,而且在SNPs中還可以充當(dāng)脂質(zhì)外層膜的成分之一。靶向型NPs與細(xì)胞接觸后,可以通過與細(xì)胞膜的磷脂雙分子層進(jìn)行磷脂交換,從而快速、有效地將更多包載在載體中的藥物傳遞到細(xì)胞中。因此,SNPs作為靶向NPs的一種,可以通過更快捷的途徑將更多的藥物更高效率地傳遞進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)。本文將SNPs作為PTX的靶向納米傳遞載體,即含硫酸腦苷脂的靶向乳腺癌載紫杉醇液態(tài)氟碳納米微球(Paclitaxel-sulfatide-perfluooctylbromide nanoparticles, PTX-SNPs)。SNPs具備以下兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)：一是SNPs具有靶向乳腺癌的作用；二是SNPs與靶細(xì)胞接觸后可以更高效率地將包載的藥物傳遞到靶細(xì)胞中。因此,本文將PTX-SNPs作為PTX的靶向納米載體進(jìn)行表征、細(xì)胞毒性以及體內(nèi)藥效學(xué)等研究。二.研究方法第一部分：采用逆向蒸發(fā)方法成功制備PTX-SNPs。以載藥量(Drug loading capacity, DLC)、包封率(Encapsulation efficiency, ELC)作為主要考察指標(biāo),通過單因素分析得出脂質(zhì)的濃度(FactorA)、EPC和sulfatide的質(zhì)量比(Factor B)、PFOB的含量(Factor C)和PTX的用量(Factor D)為主要影響因素,并通過四因素三水平的正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)得出最佳處方,成功制備了PTX-SNPs,并對其進(jìn)行表征和研究。第二部分：以小鼠乳腺癌細(xì)胞EMT6考察制劑對細(xì)胞的抑制作用,同時(shí)利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。制備空白液態(tài)氟碳納米微球(NPs)、含硫酸腦苷脂的空白液態(tài)氟碳納米微球(SNPs).紫杉醇液態(tài)氟碳納米微球(Paclitaxel-perfluooctylbromide nanoparticles, PTX-NPs)、含硫酸腦苷脂的紫杉醇液態(tài)氟碳納米微球(PTX-SNPs)以及泰素(Taxol(?))。利用MTT和流式細(xì)胞術(shù)共同考察它們的細(xì)胞抑制作用。同時(shí)以香豆素6 (Coumarin 6)作為熒光探針,進(jìn)行細(xì)胞吞噬熒光實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證處方對細(xì)胞的殺傷力強(qiáng)是由于該處方作用后的細(xì)胞內(nèi)藥物濃度相對較高。第三部分：大鼠尾靜脈分別注射faxol(?)、PTX-NPs、PTX-SNPs,給藥量為PTX 10mg/kg。建立了高效液相(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)分析方法測定了大鼠血漿中PTX的濃度,并繪制血藥濃度曲線,研究了Taxol(?)、PTX-NPs、PTX-SNPs在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。Taxol(?)、PTX-NPs、PTX-SNPs在荷瘤小鼠各個(gè)組織中藥物分布的測定,首先需要造模。將處于指數(shù)增長相的小鼠乳腺癌EMT6細(xì)胞進(jìn)行腫瘤的接種。首先,將細(xì)胞胰蛋白酶消化并收集,用培養(yǎng)介質(zhì)進(jìn)行洗滌。然后采用血球計(jì)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),離心,移走上清液。用PBS重新混懸,離心,移走上清液。按照以上方法,用PBS清洗3遍,避免殘留的FBS會(huì)引起小鼠免疫排斥。然后取0.2mL的注射用生理鹽水將沉淀好的小鼠乳腺癌EMT6細(xì)胞以1.5×107的濃度注射在5周齡BALB/c小鼠右側(cè)背部。2周后當(dāng)小鼠背部腫瘤直徑達(dá)到5-8mm左右,小鼠腫瘤總體積均勻長到約為200mm3時(shí),造模成功。荷EMT6瘤小鼠于尾靜脈注射Taxol(?)、PTX-NPs、PTX-SNPs,給藥劑量為10mg/kg。通過高效液相測定組織中藥物濃度共同觀測考察了Taxol(?)、PTX-NPs、PTX-SNPs在小鼠體內(nèi)的組織分布。冰凍切片以Coumarin 6作為模型藥物進(jìn)行觀測,將Coumarin 6、 Coumarin 6-SNPs和Coumarin 6-NPs于小鼠尾靜脈注射,分別于1h和8h將小鼠處死,取出腫瘤組織浸在多聚甲醛中,注意避光保存,切片后熒光顯微鏡下檢測。第四部分：建立小鼠乳腺癌模型,首先需要造模。造模方法同本文第三部分,造模成功后,分別于尾靜脈注射生理鹽水(對照)、空白的SNPs、Taxol(?)、 PTX-NPs和PTX-SNPs,每組給予相同PTX劑量10mg/kg。每4天注射1次,注射至第20天結(jié)束。每次注射前給小鼠稱重,測量小鼠腫瘤體積并記錄。第20天,處死小鼠,取出腫瘤組織稱重,然后浸在多聚甲醛中,石蠟中包埋,最后切片進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)。通過繪制小鼠腫瘤組織體積增長曲線、計(jì)算各組指標(biāo)的變化和進(jìn)行腫瘤切片的TUNEL凋亡檢測、新生血管密度(Microvessel density, MVD)和腫瘤壞死因子Bad等免疫組化實(shí)驗(yàn),共同評價(jià)Taxol(?)、 PTX-NPs、PTX-SNPs對小鼠乳腺癌的治療作用。三.實(shí)驗(yàn)結(jié)果1. PTX-SNPs的制備和評價(jià)采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)方法制備PTX-SNPs.以DLC、DLE和粒徑作為主要考察指標(biāo),通過單因素分析計(jì)算,確定脂質(zhì)的濃度(FactorA)、EPC和sulfatide的質(zhì)量比(Factor B)、PFOB的含量(Factor C)和PTX的用量(Factor D)四個(gè)因素為主要影響因素,并通過四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)最終得出最佳處方為：脂質(zhì)的濃度(FactorA)為1.2mg/mL、EPC和sulfatide的質(zhì)量比40：1、PFOB的體積含量(Factor C)為15%,PTX的用量(因素A)為1.3mg/mL。經(jīng)HPLC測定,優(yōu)化處方后PTX-SNPs中PTX的ELC為96.20%±0.14%,DLC為1.24mg/mL。PTX-SNPs的粒徑為237.5nm, Zeta電位為-14.7±0.7,多分散系數(shù)為0.28±0.045,馬爾文測定粒徑分布均勻。PTX-SNPs外觀為具有藍(lán)色乳光,電鏡下觀測PTX-SNPs為規(guī)則的球形或類球形,粒徑與馬爾文檢測結(jié)果基本一致。通過HPLC測定Taxol(?)、PTX-NPs和PTX-SNPs的釋放。透析14h時(shí),Taxol(?)中PTX的釋放率已經(jīng)接近100%; PTX-SNPs和PTX-NPs中PTX的釋放率分別為52.78%±1.29%和49.78%±1.28%。透析60h時(shí),PTX-SNPs和PTX-NPs中PTX的釋放率分別為87.44%±1.78%和80.80%±1.74%。PTX-SNPs和PTX-NPs中PTX的釋放特點(diǎn)是最初爆發(fā)性釋放,接著是持續(xù)、緩慢的釋放。2. PTX-SNPs的細(xì)胞毒作用為了考察PTX-SNPs對小鼠乳腺癌EMT6細(xì)胞的細(xì)胞毒作用,采用MTT法測定比較幾種制劑對小鼠乳腺癌EMT6細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。與PTX-SNPs作用后的EMT6小鼠乳腺癌細(xì)胞的活性低于游離PTX和PTX-NPs作用后的EMT6小鼠乳腺癌細(xì)胞的活性。在與PTX濃度為10μg/mL的PTX溶液、PTX-SNPs和PTX-NPs作用48h后的小鼠乳腺癌EMT6細(xì)胞早期凋亡率分別為3.9%±0.3%,4.6%±0.6%和13.6%±0.5%。當(dāng)PTX濃度上升到30μg/mL時(shí),早期凋亡率分別增長至13.1%±0.2%,13.3%±0.2%和44.9%±1.7%。我們由結(jié)果推測PTX-SNPs與小鼠乳腺癌EMT6細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí),細(xì)胞中藥物濃度分別高于與PTX-NPs和游離PTX共同作用的細(xì)胞內(nèi)藥物濃度。本文以Coumarin 6為模型藥物,聯(lián)合靶向阻斷實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證該推測。結(jié)果顯示與Coumarin 6-SNPs共同作用2h時(shí),細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度分別是Coumarin 6-NPs和Coumarin 6組的1.9倍和2.0倍。與Coumarin 6-SNPs共同作用12h時(shí),細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的趨勢和共同作用2h時(shí)趨勢一致。3. PTX-SNPs在大鼠血漿中的濃度和小鼠組織中的分布Taxol(?)在大鼠血漿中的藥物濃度在給藥2h之內(nèi)呈現(xiàn)快速消除相,在給藥8h時(shí)血漿中已經(jīng)檢測不到PTX的濃度。PTX-SNPs和PTX-NPs在大鼠血漿中的藥物濃度在給藥2h之內(nèi)也呈現(xiàn)一個(gè)快速的消除相,隨后2-8h之間伴隨相對緩慢的消除,8h以后到24h之間伴隨速度非常緩慢的消除,血藥濃度一直維持在較低的水平。PTX-SNPs和PTX-NPs給藥后PTX在組織中的分布不同于Taxol(?),作為納米制劑注射PTX-SNPs和PTX-NPs后,PTX在小鼠肝臟和脾臟的分布比注射Taxol(?)組在肝臟和脾臟的分布高。PTX-SNPs給藥后,PTX在小鼠腫瘤組織的藥物濃度明顯大于PTX-NPs和Taxol(?)給藥后的藥物濃度。4.PTX-SNPs對荷EMT6乳腺癌小鼠的治療作用PTX-SNPs、PTX-NPs和Taxol(?)治療后的抑瘤率(Tumor inhibition ratio,TIR)分別為70.8%、45.6%和34.0%；體積雙倍時(shí)間(Double time,DT)分別為(11.8±2.2)、(6.3±0.4)和(5.8±0.4)天。這說明PTX-SNPs對小鼠EMT6乳腺癌的治療效果優(yōu)于PTX-NPs和Taxol(?)的治療效果。腫瘤增長曲線和第20天稱重的腫瘤重量也和以上結(jié)果吻合。TUNEL腫瘤組織凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PTX-SNPs組凋亡率為46.83%±4.9%明顯高于PTX-NPs(30.91％±3.52%)和Taxol(?)(24.27％±5.32％)等其他各組。同時(shí)免疫組化實(shí)驗(yàn)如MVD和Bad實(shí)驗(yàn)同樣驗(yàn)證了PTX-SNPs可以通過促進(jìn)腫瘤Bad的分泌和減少腫瘤MVD的生長,從而有效的促進(jìn)乳腺癌組織細(xì)胞凋亡。四.研究結(jié)論本課題研究成功制備了PTX-SNPs靶向給藥系統(tǒng)。外觀有藍(lán)色乳光,透射電鏡下形態(tài)為球形或類球形。ELC為96.20%±0.14%,DLC為1.24mg/mL. PTX-SNPs的粒徑為237.5nm,Zeta電位為-14.7±0.7,多分散系數(shù)為0.28±0.045,馬爾文測定粒徑分布均勻。腫瘤狀態(tài)中的血管內(nèi)皮間隙擴(kuò)大,允許直徑小于700nm的顆粒穿過。PTX-SNPs的粒徑在200nm左右,為SNPs可以通過毛細(xì)管到達(dá)腫瘤細(xì)胞傳遞PTX提供了條件。PTX-SNPs外觀具有藍(lán)色乳光。體外模擬體內(nèi)條件透析14h時(shí),Taxol(?)中PTX的釋放率已經(jīng)接近100％;PTX-SNPs和PTX-NPs中PTX的釋放率分別為52.78%±1.29%和49.78%±1.28%。透析60h時(shí),PTX-SNPs和PTX-NPs中PTX的釋放率分別為87.44%±1.78%和80.80％±1.74％。PTX-SNPs和PTX-NPs中PTX的釋放特點(diǎn)是最初爆發(fā)性釋放,接著是持續(xù)、緩慢的釋放。在體外模擬環(huán)境中的釋放相比較Taxol(?)具有延遲效果,推測是因?yàn)榱字瑔螌幽λ幬镝尫牌鸬介y門和控制膜的作用。通過測定和比較PTX-SNPs、PTX-NPs和Taxol(?)三種制劑對小鼠乳腺癌EMT6細(xì)胞活性的影響,結(jié)果表明PTX-SNPs比PTX-NPs和Taxol(?)對小鼠乳腺癌EMT6細(xì)胞具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒作用。接著又通過早期凋亡率的測定驗(yàn)證了在共同作用48h時(shí)PTX-SNPs比PTX-NPs和Taxol(?)具有更強(qiáng)的促小鼠乳腺癌EMT6細(xì)胞凋亡的作用。以Coumarin 6作為模型藥物,通過細(xì)胞攝取載體包載藥物的實(shí)驗(yàn),證實(shí)Coumarin 6-SNPs相比Coumarin 6-NPs和Coumarin 6,可以將更多的Coumarin 6傳遞到小鼠乳腺癌EMT6細(xì)胞中。靶細(xì)胞中藥物濃度高,自然因?yàn)樗幬锂a(chǎn)生的殺傷力也更強(qiáng)。測定不同處方給藥后PTX在大鼠體內(nèi)的血藥濃度曲線和小鼠體內(nèi)的組織分布,PTX-SNPs已經(jīng)改變了PTX的藥動(dòng)學(xué)行為和組織分布。PTX-SNPs在大鼠血漿中半衰期比Taxol(?)長,在小鼠體內(nèi)EMT6腫瘤、肝臟和脾臟中分布較Taxol(?)多。靶部位藥物濃度高,治療作用強(qiáng)。因此,本文也開展了PTX-SNPs治療荷EMT6乳腺癌小鼠的初步藥效學(xué)研究。通過測量腫瘤體積、繪制體積-時(shí)間增長曲線,腫瘤稱重計(jì)算的DT、TIR等指標(biāo),共同驗(yàn)證了PTX-SNPs在小鼠體內(nèi)治療EMT6乳腺癌的療效遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于PTX-NPs和Taxol(?)。TUNEL實(shí)驗(yàn)和免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PTX-SNPs可以促進(jìn)乳腺癌組織細(xì)胞凋亡和腫瘤壞死因子Bad的分泌,同時(shí)減少腫瘤MVD的生長。這些都有助于抑制腫瘤組織的生長和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的死亡。對小鼠乳腺癌的治療,PTX-SNPs強(qiáng)于PTX-NPs和Taxol(?)的治療作用,主要得益于sulfatide對小鼠乳腺癌EMT6細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)上的TN-C的靶向作用以及SNPs高效率地傳遞藥物進(jìn)入靶細(xì)胞的能力。
【關(guān)鍵詞】：乳腺癌 紫杉醇 硫酸腦苷脂 液態(tài)氟碳納米微球 靶向 藥動(dòng)學(xué) 藥效學(xué)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R943;R96
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-21
• 前言21-31
• 參考文獻(xiàn)27-31
• 第一章 PTX-SNPs的制備與評價(jià)31-60
• 1.1 儀器與材料31-32
• 1.2 PTX-SNPs載藥量和包封率的測定方法32-36
• 1.3 過濾和離心法測定載藥量和包封率36
• 1.4 PTX-SNPs制備的單因素考察36-46
• 1.5 PTX-SNPs制備的處方篩選46-50
• 1.6 PTX-SNPs的制備和表征50-55
• 1.7 討論55-57
• 1.8 小結(jié)57-58
• 參考文獻(xiàn)58-60
• 第二章 PTX-SNPs體外抗腫瘤作用研究60-79
• 2.1 細(xì)胞系、材料和儀器60-61
• 2.2 細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)(MTT法)及結(jié)果61-67
• 2.3 凋亡率的測定67-70
• 2.4 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)70-74
• 2.5 討論74-76
• 2.6 小結(jié)76
• 參考文獻(xiàn)76-79
• 第三章 PTX-SNPs體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)及組織分布研究79-103
• 3.1 儀器與材料80-81
• 3.2 HPLC法測大鼠血漿的濃度和結(jié)果81-86
• 3.3 小鼠組織藥物濃度的測定86-98
• 3.4 討論98-100
• 3.5 小結(jié)100
• 參考文獻(xiàn)100-103
• 第四章 PTX-SNPs對小鼠乳腺癌的治療作用103-126
• 4.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料103-104
• 4.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型和給藥方案104-105
• 4.3 動(dòng)物監(jiān)控和結(jié)果105-110
• 4.4 TUNEL測定腫瘤組織細(xì)胞凋亡110-114
• 4.5 免疫組化測定新生血管密度和腫瘤壞死因子Bad114-119
• 4.6 PTX-SNPs的體內(nèi)毒性119-121
• 4.7 討論121-123
• 4.8 小結(jié)123
• 參考文獻(xiàn)123-126
• 全文結(jié)論126-128
• 論文的不足之處和下一步的工作128-129
• 綜述129-136
• 參考文獻(xiàn)133-136
• 中英文縮略詞表136-138
• 發(fā)表論文138-140
• 致謝140-142
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)證明142

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本文編號：868771