本文關(guān)鍵詞：槐耳抑制乳腺癌的分子網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及53BP1抑癌分子通路研究

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【摘要】：研究目的乳腺癌是全世界女性常見的惡性腫瘤之一。隨著人們對疾病認(rèn)識的深入,“乳腺癌是一種全身性疾病”這一論點(diǎn)已被人們廣泛接受,在此認(rèn)識的基礎(chǔ)上,乳腺癌的治療已發(fā)展成集手術(shù)治療、化療、放療、內(nèi)分泌治療及生物靶向治療及中醫(yī)藥治療等多種方式于一體的綜合治療體系。中藥作為乳腺癌系統(tǒng)性輔助治療的一部分,在乳腺癌治療中的應(yīng)用已引起越來越多的重視。中藥的每種組成成分通常具有多種作用,且各組成成分之間又有復(fù)雜的相互作用,因此重要通常為多靶點(diǎn)作用方式,具有辨證性及整體性,在癌癥治療的臨床應(yīng)用中有其獨(dú)到的作用及廣泛的應(yīng)用前景�；倍且环N具有抗癌作用的中藥,其正式問世時(shí)是作為原發(fā)性肝癌的輔助用藥之一,臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)其有明顯的抗肝癌作用,但其作用機(jī)制尚不完全明確。隨后,槐耳開始應(yīng)用在乳腺癌的輔助治療中,且在臨床應(yīng)用中也表現(xiàn)出其抗癌性。作為中藥的典型代表,槐耳的作用同樣具有辨證性和整體性,因此,對其作用機(jī)制的研究也必須從全面、整體的角度出發(fā),而不能局限在傳統(tǒng)的研究方法中�；蛐酒且环N近幾十年間迅速發(fā)展起來的新興技術(shù),利用基因芯片技術(shù)可以檢測數(shù)以千計(jì)甚至數(shù)以萬計(jì)的基因表達(dá)信息。利用基因芯片檢測出的基因信息進(jìn)行深入的數(shù)據(jù)分析,可以深層次挖掘差異基因所涉及的功能及分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,對下一步的深入研究提供指導(dǎo)幫助。因此,本論文的目的就是利用基因表達(dá)譜芯片這一技術(shù),對槐耳抑制乳腺癌的作用機(jī)制展開全面檢測及分析。利用基因芯片技術(shù),我們將篩選出槐耳作用于乳腺癌細(xì)胞所引起的發(fā)生顯著性變化的功能及分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,揭示槐耳抑制乳腺癌的分子機(jī)制,并為后續(xù)深入研究提供指導(dǎo)。同時(shí),我們也將定位在槐耳抑制乳腺癌中起到關(guān)鍵作用的基因,并對其功能和作用機(jī)制展開深入研究,力求為乳腺癌的新藥研發(fā)提供新的靶點(diǎn)。研究方法為了研究槐耳抑制乳腺癌細(xì)胞的具體作用機(jī)制,我們首先用MTT的實(shí)驗(yàn)方法檢測了槐耳對乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞抑制作用,并根據(jù)MTT的實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇適宜的藥物作用濃度和作用時(shí)間,以刺激乳腺癌細(xì)胞。然后,從經(jīng)槐耳刺激的乳腺癌細(xì)胞中提取RNA,進(jìn)行基因表達(dá)譜芯片的檢測。從芯片結(jié)果中,利用倍數(shù)法的方法初步篩選出表達(dá)差異基因,并用實(shí)時(shí)定量PCR的方法對芯片中的部分結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。然后通過Gene Ontology(GO)分析對表達(dá)差異基因參與的生物學(xué)功能進(jìn)行研究,通過Pathway分析對表達(dá)差異基因參與的分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行分析。最后,將GO分析得到的有顯著變化的差異基因和Pathway分析得到的差異基因取交集,在Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)數(shù)據(jù)庫的指導(dǎo)下,將交集基因繪制成能夠直觀反映變化的關(guān)鍵基因的基因間相互作用網(wǎng)絡(luò)圖,從而揭示槐耳作用于乳腺癌細(xì)胞的多靶點(diǎn)作用方式。在基因芯片結(jié)果的提示下,我們通過Western blot和實(shí)時(shí)定量PCR的方法,對潛在的關(guān)鍵抑癌基因53BP1的表達(dá)變化進(jìn)行了檢測。為了拓展研究53BP1的基因功能,我們通過構(gòu)建載體和細(xì)胞轉(zhuǎn)染等方法,篩選出53BP1過表達(dá)及干擾的乳腺癌細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)研究。我們通過細(xì)胞形態(tài)觀察、Western blot、實(shí)時(shí)定量PCR和細(xì)胞免疫熒光化學(xué)等實(shí)驗(yàn)方法,檢測篩選出的乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)標(biāo)志性分子的表達(dá)變化。然后,用Transwell的實(shí)驗(yàn)方法探究53BP1對乳腺癌細(xì)胞系遷移和侵襲能力的影響。為了明確53BP1抑制乳腺癌細(xì)胞EMT的具體作用機(jī)制,我們采用Western blot和實(shí)時(shí)定量PCR的方法,對可能的信號通路進(jìn)行了檢測。為明確通路中microRNA (miRNA)的作用,我們向細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miRNA mimic及miRNA inhibitor,然后用Western blot和Transwell實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證miRNA在53BP1抑制乳腺癌細(xì)胞EMT過程中的作用機(jī)制。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)水平,我們構(gòu)建了裸鼠皮下成瘤模型,用免疫組織化學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法檢測腫瘤組織中EMT關(guān)鍵分子的表達(dá)情況,來驗(yàn)證體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。最后,我們用實(shí)時(shí)定量PCR的方法,在臨床手術(shù)標(biāo)本組織中檢測了53BP1、miRNA和ZEB1等關(guān)鍵分子的表達(dá),來進(jìn)一步明確我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著槐耳溶液藥物濃度和作用時(shí)間的增加,兩種乳腺癌細(xì)胞的存活數(shù)量均越來越少,即槐耳對乳腺癌細(xì)胞系的抑制作用呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性和時(shí)間依賴性。根據(jù)MTT的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們選擇用8mg/mL的槐耳溶液刺激乳腺癌細(xì)胞72h,然后進(jìn)行基因芯片的檢測。首先,倍數(shù)法初步篩選表達(dá)差異基因的結(jié)果顯示,經(jīng)槐耳刺激后,MDA-MB-231細(xì)胞系中差異基因共有1655個(gè),其中有907個(gè)基因表達(dá)上升,748個(gè)基因表達(dá)下降；而MCF-7細(xì)胞系中差異基因共有1320個(gè),其中表達(dá)上調(diào)的有600個(gè),表達(dá)下調(diào)的有720個(gè)。在兩種乳腺癌細(xì)胞系中,槐耳共同調(diào)節(jié)的差異基因共有172個(gè),其中98個(gè)發(fā)生上調(diào),74個(gè)發(fā)生下調(diào)。為了驗(yàn)證基因表達(dá)譜芯片結(jié)果的可信度,我們用實(shí)時(shí)定量PCR的方法對結(jié)果中的部分基因結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果顯示實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果與芯片結(jié)果基本相符。然后,我們根據(jù)芯片結(jié)果進(jìn)行了生物功能學(xué)水平的GO分析。結(jié)果顯示在MDA-MB-231細(xì)胞中,共有562個(gè)GO功能發(fā)生顯著差異,其中353個(gè)GO功能發(fā)生上調(diào),209個(gè)GO功能發(fā)生下調(diào)；而在MCF-7細(xì)胞中,共有695個(gè)GO功能發(fā)生顯著差異,其中307個(gè)GO功能發(fā)生上調(diào),388個(gè)GO功能發(fā)生下調(diào)。兩種乳腺癌細(xì)胞系受槐耳共同調(diào)節(jié)的GO功能共有129個(gè),其中77個(gè)發(fā)生上調(diào),52個(gè)發(fā)生下調(diào)。然后,我們從信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路水平進(jìn)行了Pathway分析,分析結(jié)果顯示,在MDA-MB-231細(xì)胞中,槐耳顯著調(diào)節(jié)信號通路104條,其中59個(gè)通路上調(diào),45個(gè)通路發(fā)生下調(diào)；在MCF-7細(xì)胞中,共有77條通路發(fā)生了顯著變化,其中39條發(fā)生上調(diào),38條發(fā)生下調(diào)。通過將兩種細(xì)胞系發(fā)生顯著變化的通路取交集,我們發(fā)現(xiàn),共有36條通路發(fā)生變化,其中8條上調(diào),28條下調(diào)。最后,我們分別對MDA-MB-231細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞發(fā)生變化的關(guān)鍵基因構(gòu)建了其分子網(wǎng)絡(luò)圖,并將兩種細(xì)胞系共同發(fā)生變化的分子網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行了繪制,最終得出了槐耳調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的重要分子網(wǎng)絡(luò)。在芯片結(jié)果的提示下,我們發(fā)現(xiàn),槐耳作用于乳腺癌細(xì)胞后,DNA損傷修復(fù)過程中的關(guān)鍵基因53BP1發(fā)生了明顯上調(diào),這一結(jié)果與其它DNA損傷修復(fù)通路中的基因變化不符。根據(jù)我們的前期研究結(jié)果,我們推測在槐耳抑制乳腺癌細(xì)胞這一過程中,53BP1發(fā)揮了抑癌基因的功能,因此我們對53BP1基因展開了拓展性研究。在對篩選出的過表達(dá)和干擾53BP1的乳腺癌細(xì)胞的培養(yǎng)中,我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了明顯的變化,這一變化提示53BP1可能抑制了乳腺癌細(xì)胞的EMT過程,為了明確這一假設(shè),我們檢測了EMT過程中的關(guān)鍵分子,發(fā)現(xiàn)53BP1確實(shí)能夠抑制乳腺癌細(xì)胞EMT的發(fā)生。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)53BP1能夠顯著抑制乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力。為了進(jìn)一步研究其作用機(jī)制,我們檢測了EMT轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)ZEB1的表達(dá)發(fā)生了顯著改變,提示53BP1可能通過調(diào)節(jié)ZEB1從而實(shí)現(xiàn)對EMT的抑制作用。miRNA在乳腺癌的EMT過程中發(fā)揮重要作用,而ZEB1又是miR-200家族發(fā)揮作用的靶基因,因此,我們檢測了miR-200家族5個(gè)miRNA的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)miR-200b和miR-429發(fā)生了最為顯著的變化。然后我們在高表達(dá)：niRNA的細(xì)胞中干擾miRNA,在低表達(dá)miRNA的細(xì)胞中過表達(dá)相應(yīng)的miRNA,發(fā)現(xiàn)53BP1所引起的變化均發(fā)生了逆轉(zhuǎn),提示53BP1確實(shí)通過調(diào)節(jié)miR-200b-429/ZEB1/E-cadherin這一信號通路實(shí)現(xiàn)對EMT和遷移侵襲能力的抑制。最后,我們從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)水平和臨床標(biāo)本水平驗(yàn)證了體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。結(jié)論1.槐耳對乳腺癌細(xì)胞有明顯的抑制作用。2.槐耳對乳腺癌的抑制作用呈現(xiàn)多靶點(diǎn)、整體性的特點(diǎn),涵蓋乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中多個(gè)重要生物學(xué)功能及分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。3.槐耳能夠上調(diào)抑癌基因53BP1的表達(dá)。4.53BP1能夠通過調(diào)節(jié)miR-200b-429/ZEB1/E-cadherin通路抑制乳腺癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和浸潤轉(zhuǎn)移。意義1.用基因表達(dá)譜芯片的方式,揭示了槐耳對乳腺癌細(xì)胞的多靶點(diǎn)作用方式,為槐耳治療乳腺癌提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證據(jù),并為今后對槐耳作用機(jī)制的研究提供指導(dǎo)方向。2.從槐耳抑制乳腺癌的基因表達(dá)譜芯片中篩選出抑癌基因53BP1,為新藥開發(fā)提供了新的靶點(diǎn)。3.研究了53BP1通過miR-200b-429/ZEB1/E-cadherin通路抑制乳腺癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和浸潤轉(zhuǎn)移,揭示了抑癌基因53BP1的作用機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：乳腺癌 槐耳 基因表達(dá)譜芯片 53BP1 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R285
【目錄】：

• 中文摘要6-11
• 英文摘要11-16
• 符號說明16-17
• 前言17-21
• 第一部分 利用基因表達(dá)譜芯片分析槐耳分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究21-67
• 材料與方法21-36
• 結(jié)果36-65
• 討論65-67
• 第二部分 槐耳調(diào)控53BP1及53BP1抑癌分子通路研究67-98
• 材料與方法67-87
• 結(jié)果87-95
• 討論95-98
• 結(jié)論98-99
• 參考文獻(xiàn)99-104
• 致謝104-105
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文105-107
• 英文論文1107-130
• 英文論文2130-151
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況151

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李凱;陶京;李_";許州;楊智勇;熊炯p，

本文編號：868361