本文關(guān)鍵詞：胃癌不同分化層級(jí)細(xì)胞的分離鑒定及在過(guò)繼免疫治療中的應(yīng)用

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【摘要】：背景胃癌是全球范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其死亡率居惡性腫瘤第二位。常規(guī)治療后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是胃癌患者死亡的重要原因。因此如何遏制胃癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是目前研究的重點(diǎn),而近年來(lái)腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells, CSC)理論的提出為胃癌治療提供了新的思路。CSC理論認(rèn)為,只有一小部分腫瘤細(xì)胞具有自我更新和無(wú)限增殖能力,并由此產(chǎn)生大量相對(duì)成熟的常規(guī)腫瘤細(xì)胞(regular cancer cells, RCC),這些處于腫瘤分化層級(jí)頂點(diǎn)的細(xì)胞亞群是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源。研究人員堅(jiān)信只有真正消滅CSC,才能根除腫瘤。但到目前為止,仍缺少合適的篩選CSC方法,這也極大的限制了人們對(duì)包括胃癌干細(xì)胞(gastric cancer stem cells, GCSC)在內(nèi)的CSC研究。我們知道,正常祖細(xì)胞群仍具有一定程度的“干性”,同時(shí)也表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物。以此類推,腫瘤祖細(xì)胞(cancer progenitor cells, CPC)也極有可能具有這種特點(diǎn)。而目前篩選CSC的辦法無(wú)法排除CPC的存在,因此也有研究用到了CSC/CPC來(lái)描述獲得的干性細(xì)胞群。然而CSC與CPC的生物學(xué)特性可能存在著較大差異,這種混雜的細(xì)胞群可能無(wú)法真實(shí)反映出這兩個(gè)細(xì)胞亞群的生物學(xué)特性。另一方面,CSC理論是建立在正常組織干細(xì)胞理論基礎(chǔ)上提出的,即腫瘤組織中應(yīng)該具有類似正常組織干細(xì)胞中由干細(xì)胞到祖細(xì)胞再到成熟細(xì)胞的漸進(jìn)分化過(guò)程。但是目前多數(shù)實(shí)驗(yàn)僅是將腫瘤細(xì)胞群?jiǎn)渭兊姆譃镃SC與非CSC,這不足以說(shuō)明這種分化過(guò)程的存在。由此可見(jiàn),如果能找到合適的方法在腫瘤細(xì)胞群中分選出CSC、CPC及RCC,將對(duì)深入了解GCSC的生物學(xué)特性及完善CSC理論有著重要意義。由于需要在腫瘤干性細(xì)胞群中篩選出干性程度高的CSC群與干性程度低的CPC群,因此只有選擇與細(xì)胞干性密切相關(guān)并可區(qū)分出強(qiáng)弱表達(dá)的標(biāo)記物才具有可行性。乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase, ALDH)具有這種特性,ALDH是細(xì)胞內(nèi)具有解毒作用的酶類,且在正常干細(xì)胞(stem cells, SC)的增殖、分化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。ALDH作為一種功能性的SC標(biāo)記物,具有在干細(xì)胞中高活性,成熟細(xì)胞中低活性或無(wú)活性的特點(diǎn),其活性的高低可以反映出細(xì)胞的干性程度。而近年來(lái),已有大量研究人員應(yīng)用ALDH活性檢測(cè)方式成功富集了CSC。雖然這些獲得的“CSC”仍存在著與CPC混雜的問(wèn)題,但基于ALDH這種隨著細(xì)胞“干性”遞減而表達(dá)量逐步下降的特點(diǎn)或許可以成為篩選腫瘤細(xì)胞中不同分化層級(jí)細(xì)胞亞群的標(biāo)記物�；跇�(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells, DC)的過(guò)繼免疫治療(adoptive cellular immunotherapy, ACI)被認(rèn)為具有良好的應(yīng)用前景,以DC荷載抗原誘導(dǎo)成熟的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic t lymphocyte, CTL)更是具有高靶向性高殺傷性腫瘤細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)已有研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用過(guò)繼免疫治療靶向CSC會(huì)取得更好的療效。但是在GCSC及胃癌祖細(xì)胞(gastric cancer progenitor cells, GCPC)方面的應(yīng)用未見(jiàn)報(bào)道。目的1.利用ALDH活性評(píng)估方式分選胃癌細(xì)胞中不同分化層級(jí)亞群2.探明胃癌細(xì)胞中不同分化層級(jí)亞群的生物學(xué)特性3.明確靶向胃癌細(xì)胞中不同分化層級(jí)亞群的CTL抑瘤效果方法1.流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)胃癌細(xì)胞系MFC中ALDH活性強(qiáng)度：根據(jù)檢測(cè)結(jié)果,選取ALDH陽(yáng)性細(xì)胞群中熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的細(xì)胞亞群作為ALDHhigh群,選取ALDH陽(yáng)性細(xì)胞群中熒光強(qiáng)度最弱的細(xì)胞亞群作為ALDHlow群,選取ALDH陰性細(xì)胞群中的相對(duì)熒光強(qiáng)度最弱的細(xì)胞亞群作為ALDHneg群。2.流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各亞群細(xì)胞CD44、CD133表達(dá)情況及細(xì)胞周期分析。3. RT-PCR技術(shù)檢測(cè)各亞群細(xì)胞OCT-4、SOX-2基因的表達(dá)情況。4.體外成球?qū)嶒?yàn)評(píng)估各亞群細(xì)胞自我更新能力。5小鼠皮下致瘤實(shí)驗(yàn)探究各亞群細(xì)胞致瘤能力。6.CCK8法檢測(cè)各亞群細(xì)胞增殖及耐藥能力。7.Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各亞群細(xì)胞侵襲能力。8.平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各亞群細(xì)胞克隆能力。9.應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果1.ALDH活性表達(dá)與MFC細(xì)胞干性相關(guān)(1)MFC中ALDH陽(yáng)性細(xì)胞群比例占5%±0.91%,我們以ALDH陽(yáng)性群中熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的1%細(xì)胞亞群作為ALDHhigh亞群,ALDH陽(yáng)性群中熒光強(qiáng)度最弱的1%細(xì)胞亞群作為ALDHlow亞群,相對(duì)無(wú)ALDH活性的1%細(xì)胞群作為ALDHneg亞群。(2)三群細(xì)胞中,CD44比例均大于90%,不適合作為MFC的干性標(biāo)記物；而隨著ALDH活性的降低,CD133比例逐漸下降,分別為(44.07%±3.97%、34.33%±3.06%、1.60%±0.66%),ALDHhigh及ALDHlow表達(dá)量明顯高于ALDHneg (P 0.01), ALDHhigh比例雖高于ALDHlow,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.09)。(3)干性基因OCT-4、SOX-2表達(dá)也呈現(xiàn)同樣的趨勢(shì),其中OCT-4在ALDHhig、ALDHlow及ALDH"eg群相對(duì)表達(dá)量分別為(0.99±0.10；0.43±0.04；0.28±0.03,P0.05)；SOX-2趨勢(shì)同OCT-4,表達(dá)量分別(1.00±0.08；0.63±0.05；0.14±0.03,P0.05)。(4)ALDHhigh及ALDHlow均可在無(wú)血清超低粘附條件下形成腫瘤球。相同時(shí)間內(nèi),ALDHhigh形成的腫瘤球體積明顯小于ALDHlow,而ALDHhigh球體內(nèi)ALDH陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯大于ALDHlow(70.1%±7.1%VS 30.5%±5.7%,P0.01);ALDHlow細(xì)胞亞群在5000/只致瘤條件下致瘤能力強(qiáng)于其他組,而在500/只致瘤條件下,ALDHhigh致瘤能力最強(qiáng)。2.ALDH不同活性細(xì)胞亞群生物學(xué)特性不同(1)ALDHlow細(xì)胞亞群體外增殖能力強(qiáng)于其他組,而ALDHhigh亞群增殖能力最低；(2)S/G2/M期在ALDHhigh、ALDHlow及ALDHneg細(xì)胞亞群中比例分別為(40.6%±4.6%；91.1%±1.3%；60.5%±3.4%)組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；(3)隨著ALDH活性下降,各細(xì)胞亞群耐藥能力逐步下降：(4)ALDHlow細(xì)胞亞群形成的克隆數(shù)量為(166.3±14.9)明顯多于其他組(P0.01),而ALDHhigh細(xì)胞亞群克隆數(shù)量多于ALDHneg細(xì)胞亞群(36.1±6.3；8.0±2.6,P0.05)。(5)ALDHhigh組侵襲能力明顯強(qiáng)于其他組(51.7±9.1,P0.05),而ALDHl0W組侵襲細(xì)胞數(shù)量與ALDHneg組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(9.7±3.5；11.7±3.6,P=0.895)。3.CTL靶向ALDH各細(xì)胞亞群具有不同的抑瘤效果CTL各治療組小鼠抑瘤率由高到底分別為CTL-ALDHlow、CTL-ALDHhigh CTL-ALDHneg(88.2%±6.3%,68.7%±11.3%；43.2%±29.6%);CTL-ALDHhigh、 CTL-ALDHlow、CTL-ALDHneg及PBS對(duì)照組外周血CD31細(xì)胞比例分別為(53.4%±2.7%；52.2%±3.8%；52.3%±6.1%；44.1%±3.2%),各治療組比例均大于PBS對(duì)照組,但CTL-ALDHneg組與PBS組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.216),各治療組之間無(wú)明顯差異。上述組序中外周血CD3+CD8+T細(xì)胞比例均高于PBS對(duì)照組(24.4%±3.2%;26.3%±1.7%；21.9%±2.5%11.5%±1.8%；P0.01)。組間無(wú)明顯差異。上述組序中脾臟血的CD3+T細(xì)胞比例分別為(20.3%±2.3%；19.06%±1.4%；19.4%±4.7%；10.2%±2.1%),各治療組比例均大于PBS對(duì)照組(P0.05),治療組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異：上述組序中脾臟血的CD3+CD8+T細(xì)胞比例分別為(6.7%±2.0%；5.4%±0.9%；5.8%±0.5%；1.8%±0.5%),各治療組比例均明顯高于PBS對(duì)照組(P0.05),各治療組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論1.胃癌干性細(xì)胞群中存在著生物學(xué)特性不同的CSC與CPC, ALDH活性分選可以作為區(qū)分CSC與CPC的方法；在干性群中排除CPC是以后提高CSC研究結(jié)果可靠度的有效方式。2.CPC與CSC相比,雖然自我更新能力較低,但增殖能力更高,短時(shí)間內(nèi)的危害要高于CSC。3.靶向CPC的CTL治療方式其抑瘤效果明顯強(qiáng)于其他組,CPC可能是未來(lái)腫瘤治療的新靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：胃癌 乙醛脫氫酶 腫瘤干細(xì)胞 腫瘤祖細(xì)胞 過(guò)繼免疫治療
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.2
【目錄】：

• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-15
• 第一部 胃癌不同分化層級(jí)細(xì)胞篩選15-38
• (一) 前言15-16
• (二) 材料和方法16-22
• (三) 結(jié)果22-26
• (四) 討論26-29
• (五) 結(jié)論29-30
• (六) 參考文獻(xiàn)30-38
• 第二部 ALDH不同活性細(xì)胞亞群生物學(xué)特性分析38-52
• (一) 前言38
• (二) 材料和方法38-42
• (三) 結(jié)果42-46
• (四) 討論46-48
• (五) 結(jié)論48-49
• (六) 參考文獻(xiàn)49-52
• 第三部 靶向ALDH不同活性細(xì)胞亞群免疫治療的實(shí)驗(yàn)研究52-66
• (一) 前言52
• (二) 材料和方法52-57
• (三) 結(jié)果57-60
• (四) 討論60-62
• (五) 結(jié)論62-63
• (六) 參考文獻(xiàn)63-66
• 總結(jié)66-67
• 綜述67-96
• 參考文獻(xiàn)74-96
• 附錄 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況96-97
• 致謝97-98

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9 楊明;促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子1型受體經(jīng)cAMP/PKA信號(hào)通路對(duì)U87MG細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

10 李廣康;RNAi沉默Rap2B基因?qū)盒赞D(zhuǎn)化BEAS-2B細(xì)胞的作用[D];鄭州大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：868043