本文關(guān)鍵詞：FTY-720P聯(lián)合同種異體骨治療骨缺損相關(guān)機制的研究

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【摘要】：研究背景隨著社會經(jīng)濟水平的進步和發(fā)展,各種原因引起的骨缺損在臨床上越來越常見,目前臨床上常見的引起骨缺損的原因如：骨腫瘤、創(chuàng)傷等,造成了嚴重的后果,尤其是由于上述原因?qū)е碌拇蠖喂侨睋p,治療修復效果差,對社會及患者本人造成了重大的負擔,因此骨缺損的修復成為臨床上函需解決的重要課題。目前主流的針對骨缺損的修復多采用移植物填充的方法,而移植物需要具有至少兩種特性即：骨傳導及骨誘導作用。骨傳導作用是指提供良好的三維支架,骨誘導作用包括BMP,VEGF和TGF-β等誘導血管或成骨細胞功能的特殊的活性因子的作用。根據(jù)上述兩種特性,目前在臨床上及實驗室中進行的骨缺損填充方法主要有三種：即自體骨移植,異體骨移植,以及新興生物學材料如：納米殼聚糖、珊瑚石等,在這些方法中,自體骨組織相容性好,并發(fā)癥少,但其來源有限,限制了其在治療的范圍；而新興生物材料由于其具體的并發(fā)癥尚不清楚,因此尚未在臨床上得到廣泛應用。因此同種異體骨成為目前臨床上解決骨缺損修復的重要材料。相比自體骨,雖然來源較多,數(shù)量充足,能夠滿足對各種類型的骨缺損進行填充,但由于其具有免疫原性,因此在臨床上應用時容易產(chǎn)生多種并發(fā)癥：如移植異體骨壞死、局部炎癥反應等問題,影響了其治療效果。如何在不影響異體骨骨傳導及骨誘導作用的前提下減輕排斥反應,減少移植異體骨引起的免疫學并發(fā)癥成為臨床上函需解決的重要課題。同種異體骨引起的免疫排斥反應原因極其復雜,因此臨床上常規(guī)采用一些方法如更新制作同種異體骨工藝、組織配型等,此類方法往往受到技術(shù)以及經(jīng)濟的限制,不能廣泛推廣應用,而通過應用免疫抑制劑的方式,不僅可以有效的減輕免疫反應,在技術(shù)和經(jīng)濟上較易于實現(xiàn),以便推廣應用,同時有些免疫抑制劑還能起到促進骨缺損修復的作用,可以作為臨床上治療骨缺損的研究方向。FTY-720(芬戈莫德,fingolimod)是自冬蟲夏草中提取的一種成分,并于實驗室中經(jīng)過改變側(cè)鏈等過程后合成,于2010年9月份通過美國FDA認證,并作為新型免疫抑制劑用于臨床上多種免疫系統(tǒng)疾病。其主要活性成分是在體內(nèi)經(jīng)過磷酸化修飾后變成FTY-720P產(chǎn)生作用,其主要通過如：影響淋巴細胞遷移、影響如樹突狀細胞、NK細胞、NKT細胞、巨噬細胞等天然免疫細胞起作用。同時該藥物對成骨也有重要的影響,國內(nèi)外學者采用各種材料復合FTY-720進行動物實驗,均取得了不錯的治療效果,但其具體機制尚不明確,因此需要進一步的研究和探索。實驗目的1、通過骨缺損動物實驗,并通過影像學評分、骨密度檢查及組織學檢查以驗證FTY-720P聯(lián)合同種異體骨治療骨缺損的效果,進一步通過熒光定量PCR初步推測其可能的治療機制。2、通過體外兩種方式的破骨細胞培養(yǎng),同時進行破骨細胞計數(shù)及破骨細胞吞噬骨片后骨陷窩計數(shù)的方式,分析FTY-720P對破骨細胞形成及其吞噬功能的影響,后通過蛋白芯片的方式,檢測應用FTY-720P和無FTY-720P破骨細胞中蛋白表達差異,推測其可能的機制,從而為下一步進行組織工程學實驗奠定理論基礎(chǔ)。實驗方法1、同種異體骨的制備：解剖完整取出新西蘭大白兔四肢長骨,采用深凍法去除其抗原性,將制備好異體骨真空包裝后,以25kGy鈷60輻照滅菌并置于4℃恒溫冰箱內(nèi)保存。2、建模及分組：采用Girolamo等方法,選用成年新西蘭大白兔,體重在2.0kg～3.0kg范圍內(nèi),性別不限,建立新西蘭大白兔脛骨單側(cè)皮質(zhì)缺損模型,然后進行隨機分組,隨機抽取12只為單純骨缺損組,12只為單純同種異體骨移植治療組,12只為單純自體骨移植對照組,12只為FTY-720P聯(lián)合同種異體骨治療組。3、影像學檢查及Lane-Sandhu影像學評分：分別于術(shù)后2周,4周,8周,12周采用耳緣靜脈注射2%戊巴比妥鈉,按照1 ml/kg麻醉實驗動物,效果滿意后首先進行X線影像學檢查,并通過三名熟悉Lane-Sandhu影像學評分標準的實驗人員進行評分,并記錄結(jié)果。4、骨密度檢測：分別于術(shù)后2周、4周、8周和12周,于各組中選取一只動物,采用耳緣靜脈注射空氣的方法處死動物后,于骨密度儀上測量骨缺損區(qū)的骨密度相對值。5、組織標本大體肉眼觀察及HE染色觀察：于術(shù)后2周、4周、8周和12周采用耳緣靜脈注射空氣法處死動物,首先進行脫鈣處理,效果滿意后進行常規(guī)HE染色處理,并于光鏡下觀察標本HE染色情況。6、熒光定量PCR檢測：于術(shù)后2周、4周、8周和12周采用耳緣靜脈注射空氣法處死動物,取標本進行SPP-1, BMP-2, VEGF, Col Ⅰ α1及S1P受體表達情況的熒光定量PCR檢測。7、RAW264.7誘導破骨細胞形成及鑒定：采用單獨應用RANKL誘導RAW264.7細胞的方法,以不同濃度的RANKL即10、25、50、100ng/ml的濃度對細胞進行培養(yǎng),同時對不同代數(shù)的RAW264.7細胞分別進行誘導,觀察RANKL最佳濃度及最佳的實驗用細胞代數(shù)。破骨細胞的鑒定：通過對細胞核計數(shù)以及抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色陽性鑒定RAW264.7細胞誘導破骨細胞的情況。8、FTY-720P對RAW264.7細胞誘導成為破骨細胞的影響：首先加入最佳濃度RANKL,后按照FTY-720P添加濃度的不同分為：0、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500ng/ml濃度組,于恒溫箱內(nèi)孵育4天后進行顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及細胞核數(shù)目,并按照破骨細胞鑒定的方法進行破骨細胞的鑒定及觀察藥物對破骨細胞形成的影響。9、BMMs獲取、誘導破骨細胞及鑒定：取1月齡大鼠四肢肱骨、股骨、脛骨主干,以BMMs培養(yǎng)液反復沖洗骨髓腔細胞至細胞培養(yǎng)皿中,并加入10ng/ml M-CSF并置入無菌新鮮牛骨切片恒溫培養(yǎng)約72小時后,添加30ng/ml RANKL。培養(yǎng)約7天后,通過對細胞核計數(shù)以及抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色陽性鑒定BMMs細胞誘導破骨細胞的情況。10、FTY-720P對BMMs誘導破骨細胞形成及吞噬功能的影響：根據(jù)加入FTY-720P的濃度不同,將上述培養(yǎng)皿分為0、500、600、700、800、900、1000、1500ng/ml濃度組于培養(yǎng)10天后,分別進行TRAP酶和F-actin染色,觀察FTY-720P對BMMs誘導破骨細胞數(shù)目的影響。后進行甲苯胺藍染色,計數(shù)骨片上骨陷窩數(shù)目,評價不同濃度FTY-720P對骨吞噬能力的影響。11、FTY-720P對BMMs誘導破骨細胞蛋白芯片研究：根據(jù)是否添加700ng/ml FTY-720P,分成實驗組與對照組。按照Raybiotech試劑盒說明,對兩組提取蛋白后進行蛋白芯片實驗,分析兩組表達的差異蛋白。實驗結(jié)果：1、影像學檢查及Lane-Sandhu影像學評分影像學檢查提示：自術(shù)后2周到術(shù)后12周,除術(shù)后第2周組外,術(shù)后第4、8、12周組采用FTY-720P聯(lián)合同種異體骨治療骨缺損組骨愈合效果與單純采用自體骨組效果相當,并優(yōu)于單純同種異體骨移植對照組和空白組。Lane-Sandhu影像學評分,采用結(jié)果提示：術(shù)后2周各組經(jīng)單因素方差分析,F=0.257,P=0.854。因P0.05,無統(tǒng)計學意義。術(shù)后4周各組經(jīng)單因素方差分析,F=170.469,P0.001。采用SNK對多個樣本均數(shù)間進行兩兩比較,按a=0.05水準,可認為實驗組(3.67±0.14)與自體骨移植對照組(3.97±0.17)評分高于同種異體骨移植對照組(3.07±0.26),同種異體骨移植對照組(3.07±0.24)高于空白組(0.63±0.24),但尚不能認為實驗組與自體骨移植對照組評分均數(shù)有統(tǒng)計學意義(P=0.109)。術(shù)后8周各組經(jīng)單因素方差分析,F=30.655,P0.001。采用SNK對多個樣本均數(shù)間進行兩兩比較,按α=0.05水準,可認為實驗組(5.73±±0.77)、單純自體骨移植對照組(6.16±0.34)及單純同種異體骨移植對照組(5.19±0.29)評分高于空白組(1.64±0.94),但尚不能認為實驗組與兩組對照組評分均數(shù)有統(tǒng)計學意義(P=0.218)。術(shù)后12周各組單因素方差分析,F=69.152,P0.001。采用SNK對多個樣本均數(shù)間進行兩兩比較,按α=0.05水準,可認為實驗組(7.93±±0.57)、單純自體骨移植對照組(8.76±±0.64)與單純同種異體骨移植對照組(6.99±0.37)評分高于空白組(2.36±0.74),且自體骨移植對照組(8.76±±0.64)評分大于單純同種異體骨移植對照組(6.99±0.37),但尚不能認為實驗組與自體骨移植對照組(P=0.126)、實驗組與同種異體骨對照組(P=0.089)評分均數(shù)有統(tǒng)計學意義。2、骨密度檢測術(shù)后2周各組骨密度結(jié)果進行單因素方差分析,F=98.359,P0.001。采用SNK對多個樣本均數(shù)間進行兩兩比較,按a=0.05水準,可認為自體骨移植對照組(0.64±0.02)大于實驗組(0.60±±0.02),實驗組(0.60±±0.02)大于單純同種異體骨對照組(0.47±0.02),三組均大于空白組(0.40±0.02)。術(shù)后4周各組骨密度結(jié)果進行單因素方差分析,F=13.370,P=0.002。采用SNK對多個樣本均數(shù)間進行兩兩比較,按a=0.05水準,可認為實驗組(1.24±0.03)、單純自體骨移植對照組(1.30±0.05)與單純同種異體骨移植對照組(1.19±0.02)相對骨密度值高于空白組(1.00±0.10),但尚不能認為實驗組與兩組對照組相對骨密度的均數(shù)之間有統(tǒng)計學意義P=0.138。術(shù)后8周各組骨密度結(jié)果進行單因素方差分析,F=21.433,P0.001。采用SNK對多個樣本均數(shù)間進行兩兩比較,按a=0.05水準,可認為實驗組(1.35±0.05)、單純自體骨移植對照組(1.42±±0.04)與單純同種異體骨移植對照組(1.30±±0.02)相對骨密度值高于空白組(1.09±0.08),但尚不能認為實驗組與兩組對照組相對骨密度的均數(shù)之間有統(tǒng)計學意義P=0.066。術(shù)后12周各組骨密度結(jié)果進行單因素方差分析,F=33.971,P0.001。采用SNK對多個樣本均數(shù)間進行兩兩比較,按a=0.05水準,可認為實驗組(1.51±0.07)、單純自體骨移植對照組(1.60±0.03)與單純同種異體骨移植對照組(1.50±0.04)相對骨密度值高于空白組(1.17±0.07),但尚不能認為實驗組與兩組對照組相對骨密度的均數(shù)之間有統(tǒng)計學意義P=0.148。3、組織標本大體肉眼觀察及HE染色觀察術(shù)后2周各組均可見血性及炎癥細胞滲出,其中自體骨移植對照組及實驗組炎癥滲出相對較其他兩組少,并可見移植骨殘留；術(shù)后4周,空白組炎癥細胞較前滲出增加,而其他各組炎癥細胞滲出均較前減少,同時仍舊可見移植骨殘留,移植骨周圍可見炎癥細胞圍繞；術(shù)后8周,各組中血性及炎癥細胞滲出較前明顯減少,各組均呈現(xiàn)出修復狀態(tài),預實驗組及自體骨移植對照組相比,同種異體骨移植對照組可見其修復部位骨排列紊亂；術(shù)后12周,各組恢復情況不同,空白組可見于兩斷端部分主要以肉芽組織填充為主,而自體骨移植對照組恢復好,同種異體骨移植對照組仍舊骨小梁排列紊亂,實驗組中仍舊可見少量同種異體骨殘留。4、熒光定量PCR結(jié)果：通過RT-PCR檢測,結(jié)果提示術(shù)后2周,BMP-2和VEGF的表達均表現(xiàn)為單純同種異體骨移植對照組與實驗組大于自體骨移植對照組,而Col Ⅰ α1的表達表現(xiàn)為自體骨移植對照組與實驗組大于同種異體骨移植對照組,Spp-1、SIP受體表達三組之間差異無明顯統(tǒng)計學意義。術(shù)后4周,BMP-2、Spp-1和VEGF的表達表現(xiàn)為單純同種異體骨移植對照組與實驗組大于自體骨移植對照組,而Col Ⅰ α1和S1P受體表達表現(xiàn)為三組之間差異無統(tǒng)計學意義。術(shù)后8周,VEGF、 Col Ⅰ α1和S1P受體表達表現(xiàn)為自體骨移植對照組與實驗組大于單純同種異體骨對照組,而BMP-2和Spp-1的表達量三組之間差異無統(tǒng)計學意義。術(shù)后12周,BMP-2表達表現(xiàn)為單純同種異體骨對照組與實驗組表達量大于單純自體骨移植對照組,Spp-1和VEGF表達表現(xiàn)為三組差異無統(tǒng)計學意義,而Col Ⅰ α1與S1P受體表達表現(xiàn)為自體骨移植對照組表達量大于單純同種異體骨對照組與實驗組。5、RAW264.7誘導破骨細胞細胞形態(tài)學改變形態(tài)學觀察：未加入RANKL刺激的RAW264.7細胞,可見細胞呈貼壁生長,并可見細胞老化形成梭形或不規(guī)則形狀,未見多核細胞；而加入RANKL刺激的RAW264.7細胞,可見多核巨細胞生成,并可見細胞周圍有細小偽足形成。6、最佳誘導RAW264.7成為破骨細胞RANKL濃度的確定通過計數(shù)經(jīng)TRAP酶染色后破骨細胞陽性率的情況,結(jié)果提示：經(jīng)完全隨機設(shè)計方差分析,F=58.105,P0.001。采用多個樣本均數(shù)間兩兩比較的SNK-t檢驗,按照α=0.05水準,可認為以50ng/ml(8.11±0.41)與100ng/ml(7.34±0.70)的RANKL濃度培養(yǎng)出破骨細胞的陽性率大于10ng/ml(4.02±0.23)與25ng/ml(5.10±0.19)濃度培養(yǎng)出的破骨細胞陽性率,其中25ng/ml(5.10±0.19)濃度培養(yǎng)出的破骨細胞陽性率大于10ng/ml(4.02±0.23)濃度培養(yǎng)出的破骨細胞陽性率,而50ng/ml(8.11±0.41)與100ng/ml(7.34±0.70)的RANKL濃度培養(yǎng)出破骨細胞的陽性率差異無統(tǒng)計學意義(P=0.061)。7、最佳RAW264.7誘導破骨細胞細胞代數(shù)的確定通過計數(shù)經(jīng)TRAP酶染色后破骨細胞陽性率的情況,結(jié)果提示：經(jīng)完全隨機設(shè)計方差分析,F=61.064,P0.001,按照a=0.05水準,可認為不同代數(shù)RAW264.7細胞誘導破骨細胞陽性率不同,經(jīng)過多個樣本均數(shù)間兩兩比較的SNK-t檢驗,按照a=0.05水準,可認為第8(9.32±0.62)、12(8.76±0.51)、16(7.92±0.32)代RAW264.7細胞誘導破骨細胞的陽性率大于第4代(4.944±1.02),第4代(4.94±1.02)RAW264.7細胞誘導破骨細胞的陽性率大于第24代(2.07±0.70)破骨細胞陽性率,而第8(9.32±0.62)、12(8.76±0.51)、16(7.92±0.32)代RAW264.7細胞誘導破骨細胞的陽性率差異無統(tǒng)計學意義(P=0.069)。8、不同濃度FTY-720P對RAW264.7細胞誘導形成破骨細胞的影響通過計數(shù)經(jīng)TRAP酶染色后破骨細胞陽性率的情況,結(jié)果提示：經(jīng)完全隨機設(shè)計方差分析,F=250.638,P0.001,按照a=0.05水準,可認為不同濃度FTY-720P導致RAW264.7細胞誘導破骨細胞陽性率不同,經(jīng)過多個樣本均數(shù)間兩兩比較的SNK-t檢驗,按照a=0.05水準,可認為無添加FTY-720P(9.37±0.54)和添加濃度為500(9.02±0.49)、600ng/ml(8.89±0.60)組誘導破骨細胞陽性率大于添加700ng/ml (7.72±0.41)FTY-720P組,而700ng/ml(7.72±0.41)FTY-720P組誘導破骨細胞陽性率大于添加800(3.30±0.48)、900ng/ml(2.80±0.52)FTY-720P組,而1000(1.22±0.39)、1500(0.47±0.16)、2000(0.42±0.19)、2500ng/ml(0.56±0.22) FTY-720P組破骨細胞陽性率最低(P=0.377)。9、BMMs細胞誘導及FTY-720P對誘導破骨細胞影響自骨髓中提取出的BMMs,細胞多成圓形或多角形,并可見少量細胞呈現(xiàn)梭形,細胞以單個細胞核細胞為主,未見多個核細胞。加入M-CSF和RANKL誘導24小時后,部分細胞出現(xiàn)梭形改變,并逐漸壞死并漂浮在培養(yǎng)液表面；誘導培養(yǎng)至第4天后,培養(yǎng)基中出現(xiàn)少量體型較大細胞,并可見細胞呈多核,并伸出觸角；至第7天,培養(yǎng)集中可見數(shù)量較多的多核巨細胞,細胞生長出較多偽足,經(jīng)TRAP酶染色及F-actin染色,證明該種巨型多核細胞為破骨細胞。10、FTY-720P對BMMs細胞誘導成的破骨細胞吞噬功能的影響通過采用甲苯胺藍染色后,對每張骨片上的陷窩數(shù)進行計數(shù),結(jié)果提示：經(jīng)完全隨機設(shè)計方差分析,F=68.173,P0.001,按照a=0.05水準,可認為不同濃度FTY-720P導致BMMs細胞誘導破骨細胞吞噬骨片功能不同,經(jīng)過多個樣本均數(shù)間兩兩比較的SNK-t檢驗,按照a=0.05水準,可認為無添加FTY-720P(147.58±13.27)和添加濃度為500(136.21±12.71)、600ng/ml(129.93±10.68)組誘導出破骨細胞吞噬骨片后形成的陷窩數(shù)大于添加700ng/ml(96.47±13.11)FTY-720P組,而700ng/ml(96.47±13.11)FTY-720P組誘導出破骨細胞吞噬骨片后形成的陷窩數(shù)大于添加800(47.32±14.59)、900ng/ml(31.13±9.08)FTY-720P組,而800(47.32±14.59)、900(31.13±9.08)、1000(19.79±8.41)、1500ng/ml(19.03±8.95)FTY-720P組誘導出破骨細胞吞噬骨片后形成的陷窩數(shù)之間差別無統(tǒng)計學意義(P=0.180)。11、FTY-720P對BMMs細胞誘導成的破骨細胞蛋白芯片的研究根據(jù)有無添加700ng/mlFTY-720P將細胞分為實驗組和對照組,其中實驗組有FTY-720P添加,而對照組無FTY-720P添加,進行蛋白芯片實驗后,結(jié)果提示：(1)白介素、腫瘤壞死因子、轉(zhuǎn)化生長因子家族蛋白、MMP類蛋白、趨化因子等蛋白表達在對照組及實驗組中存在差異；(2)IL-4、IL-6、IL-12、MMP-2、 VEGF-C及GFR alpha-1、堿性FGF、MIP-2在實驗組中表達較高。實驗結(jié)論1、通過影像學檢查、影像學評分、骨密度檢查及HE染色觀察結(jié)果提示同種異體骨復合FTY-720P能夠取得和自體骨移植相近的修復骨缺損的效果。2、通過熒光定量PCR實驗,并不能準確闡明FTY720P聯(lián)合同種異體骨治療骨缺損的具體治療機制,僅能提示可能與BMP-2、VEGF和Spp-1表達有關(guān),因此需要進一步進行細胞實驗闡明FTY720P具體作用機制。3、通過計數(shù)經(jīng)TRAP酶染色后破骨細胞陽性率的情況,明確了RAW264.7細胞最佳的誘導破骨細胞的細胞代數(shù)及最佳的誘導其形成破骨細胞的RANKL濃度,并證明FTY-720P可以有效抑制RAW264.7誘導成為破骨細胞。4、通過TRAP酶和F-actin染色由BMMs誘導破骨細胞及甲苯胺藍染色后計數(shù)由BMMs誘導成為破骨細胞后吞噬骨片的骨陷窩實驗,證明FTY-720P可以降低由BMMs誘導破骨細胞的數(shù)目及吞噬骨片功能。5、通過蛋白芯片研究,結(jié)果提示FTY-720P極有可能通過高表達IL-4,降低IL-1、3的表達,控制破骨細胞的形成及功能,具體機制本實驗尚不能證明,需要繼續(xù)進行成骨細胞的實驗及進一步的蛋白實驗來闡述其治療機制。
【關(guān)鍵詞】：FTY-720P 同種異體骨 RAW264.7細胞 BMMs細胞 破骨細胞 蛋白芯片
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R687
【目錄】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-26
• 前言26-33
• 參考文獻29-33
• 第一部分 FTY-720P聯(lián)合同種異體骨移植治療骨缺損效果的動物實驗研究33-81
• 一、引言33
• 二、材料和方法33-42
• 三、結(jié)果42-72
• 四、討論72-77
• 參考文獻77-81
• 第二部分 FTY-720P對體外誘導破骨細胞分化及功能的影響81-129
• 一、引言81
• 二、材料和方法81-90
• 三、結(jié)果90-119
• 四、討論119-124
• 參考文獻124-129
• 綜述129-148
• 參考文獻140-148
• 全文總結(jié)148-149
• 攻讀學位期間成果149-150
• 中英文縮略詞對照表150-152
• 致謝152-154
• 統(tǒng)計學證明154

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本文編號：846766