本文關(guān)鍵詞：RMP在肝臟惡性腫瘤中對(duì)自噬的調(diào)節(jié)及治療應(yīng)用

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【摘要】：第一部分RMP在肝臟惡性腫瘤中對(duì)自噬的調(diào)節(jié)依賴于p53的狀態(tài)研究背景和目的肝臟惡性腫瘤(Hepatic malignancy)嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康。其中,肝癌(Liver cancer)是成人常見(jiàn)的肝臟惡性腫瘤,其發(fā)病率和死亡率均位于惡性腫瘤前十位。原發(fā)性肝癌(Primary liver cancer, PLC)最重要的病理類(lèi)型是肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC),約70-85%為此類(lèi)型。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌與病毒感染、環(huán)境污染、遺傳易感等多種因素相關(guān),然而其發(fā)生發(fā)展的具體分子機(jī)制仍不清楚。目前對(duì)于肝癌的基礎(chǔ)研究越來(lái)越深入,針對(duì)肝癌的治療策略也越來(lái)越多樣,其中手術(shù)切除是肝癌治療最重要的方式。盡管臨床對(duì)于肝癌的分類(lèi)、分型和分期日趨完善,但肝癌的整體治療效果難以令人滿意,究其原因,肝癌異質(zhì)性是導(dǎo)致治療效果差強(qiáng)人意的主要原因。因此,研究肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制能夠?yàn)楦蛹?xì)致的肝癌分類(lèi)、分型提供分子基礎(chǔ)。肝母細(xì)胞瘤(Hepatoblastoma, HB)是嬰幼兒最常見(jiàn)的肝臟惡性腫瘤,約15%的肝母細(xì)胞瘤合并有遺傳綜合征,同時(shí),多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)肝母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展與Wnt信號(hào)通路、Hedgehog信號(hào)通路等相關(guān)。因此,對(duì)肝母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究有利于我們對(duì)于肝臟惡性腫瘤更加立體、更加細(xì)致的認(rèn)識(shí)。自噬是細(xì)胞內(nèi)保守的生物進(jìn)程,其通過(guò)溶酶體途徑降解細(xì)胞內(nèi)的錯(cuò)誤折疊蛋白,損傷的細(xì)胞器等,成為細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)分解再利用的重要方式。然而,過(guò)度的自噬同樣可以引起細(xì)胞死亡。自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用也呈雙向性,不同腫瘤、不同背景中的研究結(jié)果截然不同。自噬既能抑制腫瘤發(fā)生,又能通過(guò)抑制p53的激活促進(jìn)腫瘤發(fā)生；自噬既能通過(guò)對(duì)抗慢性炎癥、組織損傷和基因組不穩(wěn)定發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)展的作用,又能為應(yīng)激情況下腫瘤的生存發(fā)展提供必需的物質(zhì)。在同一腫瘤、不同分子背景的腫瘤中,自噬也發(fā)揮著雙向調(diào)節(jié)的作用。小鼠胰腺導(dǎo)管腺癌中的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),在p53正常存在的情況下,自噬發(fā)揮促進(jìn)腫瘤的作用,當(dāng)敲除p53后,自噬發(fā)揮抑制腫瘤的作用。那么,在肝臟惡性腫瘤中,自噬究竟發(fā)揮怎樣的調(diào)節(jié)作用呢?RMP (RNA polymerase subunit 5-mediating protein)是RNA聚合酶第5亞基的調(diào)節(jié)蛋白。已經(jīng)發(fā)現(xiàn),RMP在多種腫瘤組織中高表達(dá),并通過(guò)誘導(dǎo)DNA損傷、抑制凋亡、促進(jìn)轉(zhuǎn)移等機(jī)制發(fā)揮促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。然而,RMP對(duì)腫瘤自噬的調(diào)節(jié)作用尚無(wú)相關(guān)研究。因此,我們以肝臟惡性腫瘤為研究對(duì)象,通過(guò)干擾RMP慢病毒建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,在細(xì)胞水平檢測(cè)了干擾RMP對(duì)腫瘤細(xì)胞自噬的影響。發(fā)現(xiàn)了RMP在不同背景肝臟惡性腫瘤細(xì)胞中對(duì)自噬的分化調(diào)節(jié),并研究了這種分化調(diào)節(jié)可能額分子機(jī)制。研究方法1.收集肝母細(xì)胞瘤組織樣品,分別使用Western blot和RT-PCR檢測(cè)冰凍組織樣品中RMP的蛋白水平和mRNA水平；使用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)蠟塊組織切片中RMP的表達(dá)。2.選擇肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞系HepG2細(xì)胞和Huh6細(xì)胞,肝細(xì)胞癌細(xì)胞系SMMC7721細(xì)胞和Huh7細(xì)胞,分別用干擾RMP慢病毒構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。CCK-8和EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾RMP對(duì)肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的影響。3.平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾RMP對(duì)肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞克隆形成的影響。4.使用SA-β-gal染色實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞免疫免疫熒光檢測(cè)γ-H2AX的表達(dá),檢測(cè)干擾RMP對(duì)肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞衰老的影響。5.檢測(cè)自噬溶酶體途徑直接底物p62的蛋白水平,反映干擾RMP對(duì)肝臟腫瘤細(xì)胞自噬的影響。6.檢測(cè)對(duì)照組細(xì)胞和干擾RMP細(xì)胞中衰老相關(guān)分子的表達(dá)。因?yàn)閜53對(duì)細(xì)胞增殖、衰老等呈單向調(diào)節(jié),而對(duì)自噬調(diào)節(jié)呈雙向調(diào)節(jié),選擇p53作為此項(xiàng)研究的興趣分子。7.使用CHX抑制翻譯檢測(cè)p53半衰期,使用DNA損傷性藥物Dox檢測(cè)p53的活性,研究肝臟惡性腫瘤細(xì)胞中p53的狀態(tài)。8.使用過(guò)表達(dá)RMP質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染肝臟惡性腫瘤細(xì)胞,Western blot檢測(cè)p53蛋白。進(jìn)一步驗(yàn)證RMP對(duì)p53蛋白的調(diào)節(jié)作用。9.使用免疫共沉淀檢測(cè)MDM2與p53結(jié)合的能力。10.使用免疫共沉淀檢測(cè)p53與泛素分子UB的結(jié)合能力,反映p53的泛素化及總蛋白泛素化。11.使用RT-PCR檢測(cè)p53下游靶基因的表達(dá),使用胞漿胞核分離技術(shù)檢測(cè)干擾RMP后,細(xì)胞各組分中p53蛋白的變化。研究結(jié)果1.RMP在肝母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)：肝母細(xì)胞瘤冰凍組織和石蠟包塊組織中,RMP均高表達(dá)。2.RMP對(duì)肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的影響：干擾RMP能明顯抑制肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞HepG2和Huh6的增殖能力。3.RMP對(duì)肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞克隆形成的影響：干擾RMP能明顯抑制肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞HepG2和Huh6的克隆形成能力。4-RMP對(duì)肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞衰老的影響：干擾RMP能促進(jìn)肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞HepG2和Huh6發(fā)生衰老。5.RMP對(duì)肝臟惡性腫瘤細(xì)胞自噬的影響：在HepG2細(xì)胞和SMMC7721細(xì)胞中,干擾RMP抑制自噬；在Huh6細(xì)胞和Huh7細(xì)胞中,干擾RMP促進(jìn)自噬。6.RMP對(duì)衰老相關(guān)分子的調(diào)節(jié)：干擾RMP明顯上調(diào)衰老相關(guān)分子p16、p53、p21的表達(dá)。7.不同肝臟惡性腫瘤細(xì)胞中p53的狀態(tài)：HepG2細(xì)胞和SMMC7721細(xì)胞中的野生型p53半衰期約20-30分鐘,能夠被Dox激活；Huh6細(xì)胞和Huh7細(xì)胞中突變型p53半衰期約6-8小時(shí),Dox刺激下蛋白不上調(diào)。8.RMP對(duì)p53蛋白的調(diào)節(jié)：過(guò)表達(dá)RMP能夠明顯下調(diào)p53蛋白。9.RMP對(duì)MDM2與p53結(jié)合能力的影響：干擾RMP,MDM2與p53的結(jié)合明顯減少。10.RMP對(duì)p53蛋白泛素化和總蛋白泛素化的影響：干擾RMP,明顯減少p53蛋白泛素化和總蛋白泛素化。因此,RMP通過(guò)影響p53泛素化,調(diào)節(jié)p53的蛋白穩(wěn)定性。11.RMP通過(guò)對(duì)p53蛋白的調(diào)節(jié)影響自噬：干擾RMP所誘導(dǎo)的p53蛋白并不影響下游靶基因的表達(dá)。干擾RMP主要引起胞漿中野生型p53蛋白升高,進(jìn)而發(fā)揮抑制自噬的作用。結(jié)論本研究發(fā)現(xiàn)RMP在肝母細(xì)胞瘤組織中高表達(dá)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RMP促進(jìn)了肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖、克隆形成,并抑制細(xì)胞衰老,然而RMP對(duì)細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)呈現(xiàn)雙向性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),RMP能明顯抑制p53蛋白表達(dá)。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),RMP通過(guò)促進(jìn)MDM2與p53的結(jié)合從而促進(jìn)了p53蛋白泛素蛋白酶體途徑的降解。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)RMP對(duì)p53蛋白的調(diào)節(jié)并不影響其下游靶基因的表達(dá),胞漿胞核分離實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RMP主要減少了胞漿中基礎(chǔ)p53,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞自噬。第二部分p53的狀態(tài)決定了自噬對(duì)蛋白酶體抑制劑所誘導(dǎo)的凋亡的調(diào)節(jié)作用研究背景和目的自噬是依賴于溶酶體的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的降解通路。一方面,它能將細(xì)胞內(nèi)不需要的組分降解生成細(xì)胞必須的營(yíng)養(yǎng)成分,從而實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的再利用；另一方面,當(dāng)自噬過(guò)度激活時(shí),細(xì)胞也能被這種“自我消化”式的降解途徑所損傷,引起細(xì)胞死亡。與此同時(shí),自噬與其他引起細(xì)胞死亡的方式之間也存在非常重要的聯(lián)系。自噬對(duì)于凋亡的調(diào)節(jié)因研究的背景不同呈現(xiàn)明顯的分化。一部分研究發(fā)現(xiàn),自噬能夠通過(guò)特異性地降解促凋亡分子如Caspase8等發(fā)揮抑制凋亡的作用；而自噬的特殊類(lèi)型線粒體自噬還可以通過(guò)清除受損的線粒體,減少內(nèi)源性促凋亡因子的釋放,抑制內(nèi)源性凋亡通路。然而,另一部分研究發(fā)現(xiàn),自噬相關(guān)基因能夠與Caspase8結(jié)合,促進(jìn)Caspase8的活化；同時(shí),自噬也能特異性降解內(nèi)源性自噬抑制分子,這些機(jī)制均表明自噬能夠促進(jìn)凋亡。因此,自噬對(duì)凋亡的調(diào)節(jié)作用完全取決于上下文關(guān)系。不同研究中細(xì)胞的分子背景不同,可能是引起這種“相互矛盾”結(jié)果的原因之一。p53是重要的抑癌基因,它在細(xì)胞凋亡和自噬的調(diào)節(jié)中均發(fā)揮重要作用。活化的p53在胞核中作為轉(zhuǎn)錄因子,能轉(zhuǎn)錄激活多種促凋亡靶基因；而胞漿中活化的p53能夠在線粒體與多種促凋亡分子、抑制凋亡分子相互作用,最終促進(jìn)細(xì)胞凋亡。p53對(duì)自噬調(diào)節(jié)也因研究背景的不同而呈現(xiàn)雙向性,之前的研究認(rèn)為,活化的p53在胞核中能夠激活促自噬相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄,然而最近的研究發(fā)現(xiàn),持續(xù)的DNA損傷能夠誘導(dǎo)p53轉(zhuǎn)錄激活自噬抑制分子FBXL20;胞漿中非活化的p53通過(guò)抑制自噬小體的形成發(fā)揮抑制自噬的作用。因此,我們猜想p53在自噬對(duì)凋亡的雙重調(diào)節(jié)中可能發(fā)揮重要的作用。泛素蛋白酶體途徑是細(xì)胞內(nèi)另一個(gè)重要的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)降解通路,而蛋白酶體抑制劑能在多種腫瘤細(xì)胞中引起自噬和凋亡。因此,我們使用蛋白酶體抑制劑處理肝臟惡性腫瘤細(xì)胞。發(fā)現(xiàn),其同樣能引起自噬和凋亡。然而,我們預(yù)先激活自噬后,再使用蛋白酶抑制劑處理,細(xì)胞的凋亡程度出現(xiàn)明顯分化。隨后我們發(fā)現(xiàn)p53的狀態(tài)可能是引起這種分化的原因之一。研究方法1.蛋白酶體抑制劑MG132處理肝臟腫瘤細(xì)胞,Western blot檢測(cè)p62的表達(dá),LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化以及熒光顯微鏡觀察GFP-LC3顆粒的形成,反應(yīng)MG132對(duì)肝臟腫瘤細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)。2.MG132處理細(xì)胞后,Western blot檢測(cè)PARR以及PARP cleavage的表達(dá),反應(yīng)MG132對(duì)肝臟腫瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。3. EBSS處理細(xì)胞預(yù)激活自噬,再使用MG132刺激細(xì)胞,檢測(cè)ⅠPARP、PARP cleavage的表達(dá)以及熒光顯微鏡觀察PI染色情況,判斷預(yù)激活自噬對(duì)MG132所誘導(dǎo)凋亡的影響。4. Western blot檢測(cè)MG132作用下細(xì)胞內(nèi)與自噬、凋亡相關(guān)分子的變化情況。5.對(duì)預(yù)激活自噬反應(yīng)差異的細(xì)胞中p53的鑒定,CHX抑制翻譯檢測(cè)p53半衰期,直接測(cè)序法鑒定p53是否突變,使用DNA損傷性藥物Dox檢測(cè)不同狀態(tài)p53的反應(yīng),使用DNA結(jié)合區(qū)外位點(diǎn)的磷酸化p53抗體檢測(cè)突變對(duì)于突變區(qū)外磷酸化位點(diǎn)的影響。6. Western blot檢測(cè)預(yù)激活自噬對(duì)于突變型p53蛋白的影響。7.MG132所引起突變型p53降解的原因,Western blot檢測(cè)自噬抑制劑對(duì)于突變型p53蛋白的影響,溶酶體探針檢測(cè)MG132對(duì)溶酶體的調(diào)節(jié),RT-PCR檢測(cè)MG132作用下p53的轉(zhuǎn)錄是否受到影響。研究結(jié)果1.MG132作用下,肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞HepG2、Huh6以及肝細(xì)胞癌細(xì)胞SMMC7721、Huh7的自噬均被激活。2.MG132促進(jìn)了肝臟腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。3. EBSS處理預(yù)激活自噬,再使用MG132刺激,HepG2細(xì)胞和SMMC7721細(xì)胞的凋亡增多,而Huh6細(xì)胞和Huh7細(xì)胞的凋亡減少。4.檢測(cè)相關(guān)分子變化后我們發(fā)現(xiàn)在上述兩組細(xì)胞中,MG132作用下p53蛋白變化情況正好相反。5. HepG2細(xì)胞和SMMC7721細(xì)胞中為野生型p53,而Huh6細(xì)胞和Huh7細(xì)胞中的p53在DNA結(jié)合區(qū)發(fā)生了點(diǎn)突變(Huh6-A159D,Huh7-Y220C)。6.預(yù)激活自噬明顯逆轉(zhuǎn)了MG132所誘導(dǎo)的突變型p53的降解。7.MG132作用下突變型p53蛋白降解可能依賴于溶酶體功能的超激活,以及MG132對(duì)于p53的轉(zhuǎn)錄抑制。結(jié)論本研究使用蛋白酶體抑制劑MG132處理肝臟腫瘤細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)其能激活自噬并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。預(yù)激活自噬后,再使用MG132刺激細(xì)胞,細(xì)胞的凋亡出現(xiàn)明顯分化,其中HepG2細(xì)胞和SMMC7721細(xì)胞的凋亡增多,而Huh6細(xì)胞和Huh7細(xì)胞的凋亡減少。隨后的研究發(fā)現(xiàn),兩種細(xì)胞中p53蛋白在MG132作用下變化趨勢(shì)完全相反。通過(guò)直接測(cè)序,我們識(shí)別了Huh6細(xì)胞和Huh7細(xì)胞中p53在DNA結(jié)合區(qū)的點(diǎn)突變。而預(yù)激活自噬能明顯抑制MG132所引起的突變型p53蛋白的降解,進(jìn)一步研究我們發(fā)現(xiàn),MG132可能通過(guò)激活溶酶體功能以及轉(zhuǎn)錄抑制兩種方式,促進(jìn)突變型p53的蛋白降解。
【關(guān)鍵詞】：自噬 凋亡 蛋白酶體抑制劑 p53 點(diǎn)突變 肝臟惡性腫瘤 自噬 RMP p53
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R735.7
【目錄】：

• 摘要6-12
• Abstract12-14
• 縮略詞表14-16
• 第一部分 RMP在肝臟惡性腫瘤中對(duì)自噬的調(diào)節(jié)依賴于p53的狀態(tài)16-49
• 前言16-18
• 材料和方法18-21
• 一、材料18
• 二、方法18-21
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果21-41
• 一、RMP在肝母細(xì)胞瘤組織中高表達(dá)21-22
• 二、干擾RMP抑制肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖22-24
• 三、干擾RMP抑制肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞的克隆形成24-25
• 四、干擾RMP引起肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞發(fā)生衰老25-27
• 五、干擾RMP對(duì)肝臟腫瘤細(xì)胞自噬水平的調(diào)節(jié)呈雙向性27-29
• 六、干擾RMP能引起衰老相關(guān)分子的上調(diào)29-30
• 七、RMP差異調(diào)節(jié)自噬的細(xì)胞中p53的狀態(tài)不同30-34
• 八、過(guò)表達(dá)RMP能夠下調(diào)p53蛋白34-35
• 九、RMP促進(jìn)了MDM2與p53的結(jié)合35-36
• 十、干擾RMP影響了細(xì)胞整體泛素化36-38
• 十一、RMP對(duì)自噬的調(diào)節(jié)依賴于胞漿p53的功能38-41
• 討論41-44
• 參考文獻(xiàn)44-49
• 第二部分 p53的狀態(tài)決定了自噬對(duì)蛋白酶體抑制劑所誘導(dǎo)的凋亡的調(diào)節(jié)作用49-88
• 前言49-52
• 材料和方法52-61
• 一、材料52-55
• 二、方法55-61
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果61-78
• 一、蛋白酶體抑制劑MG132可以誘導(dǎo)肝臟腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬61-63
• 二、蛋白酶體抑制劑MG132可以誘導(dǎo)肝臟腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡63-64
• 三、預(yù)先誘導(dǎo)的自噬對(duì)MG132所介導(dǎo)凋亡的調(diào)節(jié)呈現(xiàn)明顯分化64-67
• 四、p53在MG132處理的不同細(xì)胞中其蛋白水平呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)67-68
• 五、p53的狀態(tài)可能在預(yù)激活自噬對(duì)MG132所介導(dǎo)凋亡的雙向調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用68-73
• 六、突變型p53可能參與了預(yù)激活自噬對(duì)MG132所介導(dǎo)凋亡的抑制作用73-74
• 七、MG132通過(guò)多種方式介導(dǎo)了突變型p53蛋白水平的下調(diào)74-78
• 討論78-82
• 參考文獻(xiàn)82-88
• 綜述88-112
• 參考文獻(xiàn)101-112
• 在讀期間發(fā)表的論文112-113
• 致謝113-114

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本文編號(hào)：847709