本文關鍵詞：NF-κB信號通路參與介導的自噬在高血壓大鼠心血管重構的作用研究

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【摘要】：背景心肌肥厚多是由高血壓病造成的,也常見于瓣膜性心臟病,例如主動脈瓣狹窄。早期發(fā)生的改變是心臟發(fā)生代償反應,用以增加心排血量；但到后期,則可能成為不可逆轉；左心室肥厚最終會導致臨床癥狀的惡化,包括終末期心衰。近年來,對左室肥厚發(fā)生發(fā)展機制的研究已經有了新的認識,目前認為心肌肥厚是一個十分復雜的病理過程,所涉及的信號傳導途徑已經是心血管研究領域的熱點問題之一。已有實驗證明氧化應激產物ROS在心肌肥厚中起重要的作用。氧化應激信號通路中重要的是NF-κB通路。ROS產生和消除的失衡會導致代謝產物增加和營養(yǎng)的缺乏,繼而可以導致自噬發(fā)生。左室肥厚促使蛋白質在左心室聚合,當存在這樣的外部壓力時,我們認為自噬會作為一個重要的生存機制發(fā)揮著作用。我們已知,自噬是一個高度保守的細胞過程,負責清除或回收壽命長的蛋白質和細胞器,它還可提供給其它細胞二次利用的營養(yǎng),包括細胞內蛋白質和細胞器。這種行為可以為細胞提供能量。然而,在某些情況下,自噬可能是有害的,因為自噬的吞噬作用產生細胞損害。當前對于自噬在心肌肥厚中的作用有許多研究,但是其作用究竟是有益還是有害目前還不清楚,其中具體的機制亦不清楚。吡咯烷二硫代氨基甲酸脂(pyrrolidine dithiocarbamate)PDTC作為NF-κB的特異性抑制劑,主要是通過抑制IK β的降解,以此減少NF-κB的核移位來抑制NF-κB的活性。以往對于心肌肥厚的動物模型多集中在給予動物做降主動脈縮窄等進行研究。主動脈縮窄后可以產生心肌肥厚。但是手術本身也會產生應激等損害,對于評價自噬帶來不確定的因素。實驗研究心肌肥厚的動物模型還有藥物刺激,轉基因動物等,這些其他動物模型也是有各種缺陷。所以我們選擇動物模型為自發(fā)性高血壓大鼠。那么自噬在自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織中的表達會是什么樣呢?在自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥厚過程中,心肌氧化應激程度變化如何?自噬在自發(fā)性高血壓肥厚心肌表達的方式通過何種信號通路呢?ROS和氧化應激如何影響自噬呢?這與氧化應激主要的NF-κB信號通路相關性如何呢?目前國內外學者還沒有對此展開研究。目的1.探討應用核磁影像技術觀察自發(fā)性高血壓大鼠的左室變化,心功能變化；2.探討自噬及氧化應激在自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥厚時期的心肌組織中的活性表達；探討自發(fā)性高血壓大鼠時期的心肌組織的自噬活性表達與左室肥厚、心肌纖維化以及氧化應激的相關性。初步研究自噬與線粒體變化的關系。3.探討自噬在自發(fā)性高血壓大鼠活性表達的趨勢原因及可能的信號通路以及與NF-κB信號通路的相關性。探討NF-κB p65信號通路在心肌肥厚中自噬中的作用及分子機制方法對4月大的SHR和WKY大鼠各14只進行喂養(yǎng),其中7只SHR和7只WKY應用吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)治療,時間為16周。其余7只SHR和7只WKY繼續(xù)普通喂養(yǎng)。老鼠被分為4組：1)WKY大鼠(WKY)2)SHR(SHR)和3)SHR應用PDTC(SHR+PDTC),4) WKY應用PDTC(WKY+PDTC)。PDTC飲用的劑量105毫克／公斤/天。在給予PDTC進行了16周結束時,動物被用于血壓測量和試驗研究。所有實驗都是在遵守山東大學的實驗動物使用指導方針和協(xié)議。進行以下實驗：(1)各組大鼠測量體重,測量尾動脈血壓。做血液生化檢查。(2)處死前開始前進行核磁共振檢查,測定舒張末期左室內徑(LVEDd)、舒張末期室間隔的厚度(IVSd)、舒張末期左室后壁的厚度(LVPWd)、左室收縮末期面積(LVSA)、左室舒張末期面積(LVDA)、左室質量(Lvmass)、收縮末期容積(ESV)、舒張末期容積(EDV)、左室射血分數(shù)(LVEF)。(3)做心肌組織超微結構和病理學檢查,HE檢查。(4)檢測氧化應激指標MDA。(5)電鏡檢查檢測自噬的表達及與心肌肥厚各項指標相關性。(6)心肌MASSON檢查分析心肌膠原比及與自噬的相關性。(7)免疫組化檢查檢測各組大鼠自噬的表達及與心肌肥厚各項指標相關性。(8)半定量PCR檢查檢測自噬的表達及與心肌肥厚指標相關性。(9) Westen blot法檢測自噬的表達及與心肌肥厚各項指標相關性。Western blot法檢測自噬信號表達的通路。Westen blot法檢測NF-K B信號通路的相關性。結果1.實驗動物基本情況：實驗過程中共有3只大鼠死亡,WKY大鼠組一只,SHR大鼠組二只。在普通喂養(yǎng)內死亡。其他組無死亡。共25只大鼠完成實驗。2.各組大鼠基本指標比較喂養(yǎng)前,與WKY對照組比較, SHR大鼠組尾動脈收縮壓升高,差異有意義(P0.05)：喂養(yǎng)后,WKY組較前血壓上升,但是SHR組尾動脈收縮壓較WKY對照組明顯升高,有顯著性差異(P0.01), (P0.05)。SHR+PDTC組相比未經處理的SHR組血壓低30毫米汞柱。表明SHR+PDTC組呈顯著降低舒張壓和收縮壓。WKY組與WKY+PDTC組組間比較無明顯變化。3.核磁共振檢查由專人采用荷蘭philipe3.0T核磁共振儀,測取連續(xù)3個心動周期的舒張末期室間隔的厚度(IVSd)、舒張末期左室后壁的厚度(LVPWd)、左室收縮末期面積(LVSA)、舒張末期左室內徑(LVEDd)左室舒張末期面積(LVDA)、左室質量(Lvmass)、收縮末期容積(ESV)、舒張末期容積(EDV)、左室射血分數(shù)(LVEF)取其均值。LVEF各組沒有顯著性差異。SHR組IVSd、PWT、LVM、LVMI均較WKY明顯升高,有顯著性差異(P0.01),與SHR+PDTC組比較示以上結果有增高。WKY組與WKY+PDTC組IVSd、PWT、LVM、LVMI值兩組間比較無明顯差異,與SHR組、SHR+PDTC組比較有明顯差異(P0.05)。4.心肌組織病理觀察HE染色顯示：WKY組、WKY+PDTC組心肌細胞體積較小,形態(tài)較均勻,排列較整齊；SHR組心肌細胞較其他組體積變大,形態(tài)呈現(xiàn)不規(guī)則,排列紊亂；細胞壁不完全清楚,細胞連接處可見融合現(xiàn)象。SHR+PDTC組與SHR組比較示細胞體積無區(qū)別,但是細胞形態(tài)較后者規(guī)則,排列無紊亂。SHR+PDTC組與WKY組、WKY+PDTC組比較細胞體積較大。5.心肌纖維化定性及定量分析Masson染色膠原含量的檢測：WKY組心肌纖維排列整齊,心肌內冠狀動脈周圍有少量膠原沉積,心肌間質內膠原多呈長條狀分布；SHR組與WKY組比較,心肌細胞腫大,肌纖維排列紊亂,心肌冠狀動脈周圍及心肌間質膠原顯著增多,而且呈現(xiàn)交聯(lián)狀。WKY組心肌細胞腫大的現(xiàn)象明顯減少。SHR+PDTC組與SHR組比較,前者血管周圍及心肌間質膠原有所減少。定量分析測量心肌膠原容積分數(shù)(CVF)和心肌內血管周圍膠原面積(PVCA)。與WKY組相比,SHR組左室心肌組織膠原含量明顯升高(P0.01)。WKY組與WKY+PDTC組比較,左室心肌組織膠原含量無明顯區(qū)別。SHR+PDTC組與SHR組比較,前者心肌膠原含量有減少。6.氧化應激指標檢測SHR組明顯高于WKY組、WKY+PDTC組、SHR+PDTC組。WKY組與WKY+PDTC組比較無明顯區(qū)別。SHR+PDTC組高于WKY組、WKY+PDTC組。7.免疫組化檢查檢測自噬的表達及與心肌肥厚各項指標相關性。與WKY對照組相比,SHR組大鼠心肌組織中自噬表達明顯升高(P0.01)；SHR組自噬表達水平也高于SHR+PDTC組、WKY+PDTC組(P0.01)。WKY組與WKY+PDTC組大鼠比較沒有顯著性變化。SHR組自噬表達與IVST、LVM、LVMI呈明顯的正相關(r=0.74,P0.01)。8.半定量PCR檢查檢測自噬的表達及與心肌肥厚各項指標相關性。與WKY對照組相比,SHR組大鼠心肌組織中自噬表達明顯升高(P0.01)；SHR組自噬表達水平也高于SHR+PDTC組、WKY+PDTC組(P0.01)。WKY組與WKY+PDTC組大鼠比較沒有顯著性變化。9.電鏡檢查檢測自噬的表達及與心肌肥厚各項指標相關性。與WKY和SHR+PDTC對照組相比,SHR組大鼠的電鏡切片觀察結果示自噬泡明顯增多趨勢,WKY組與WKY+PDTC組比較,電鏡切片自噬泡無明顯變化。10. Westen blot檢測各組心肌組織中自噬的表達與WKY對照組相比,SHR組大鼠心肌組織中LC3-I/LC3-Ⅱ表達明顯升高(P0.01)：與WKY對照組相比,WKY+PDTC組大鼠的LC3-I/LC3-Ⅱ沒有顯著性變化。SHR組LC3-I/LC3-Ⅱ表達與IVST、LVM、LVMI呈明顯的正相關(r=0.74,P0.01)。Western blot測定AKT、AMPK、S6K、mTOR的表達；與WKY對照組相比,SHR組大鼠心肌組織中表達明顯升高(P0.01); SHR組表達水平也高于SHR+P組、WKY+P組(P0.01)。WKY組與WKY+P組大鼠比較沒有顯著性變化。Western blot測定NF-κ Bp65的表達：與WKY對照組相比,SHR組大鼠心肌組織中NF-κ Bp65的表達明顯增高。(P0.01);SHR組表達水平也高于SHR+PDTC組、WKY+PDTC組(P0.01). WKY組與WKY+PDTC組大鼠比較沒有顯著性變化。結論1.核磁共振結果顯示SHR大鼠心肌肥厚形成,心臟腔徑發(fā)生變化,心肌明顯纖維化。作為研究心肌肥厚動物模型,我們采用核磁共振檢查方法為心肌肥厚左室重構的研究奠定了基礎。2.自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織中自噬表達升高,且與心肌肥厚相關指標呈明顯正相關,提示自噬參與了自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥厚的病變過程。其中,氧化應激指標檢測示MDA在SHR組明顯增高。3.自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織纖維化與自噬有相關性。各種檢測方法的綜合應用,其中電鏡檢查可作為明顯可靠的標準。對線粒體的測量數(shù)據(jù)表明自噬與線粒體的變化密切相關。4. NF-κ Bp65信號通路有在心肌肥厚中的激活自噬作用。5. PDTC通過抑NF-κB通路抑制氧化應激,同時抑制自噬。這似乎可以提示我們自噬在心肌肥厚一定階段中的作用并不是保護,而是相反。背景主動脈重構是一系列復雜的分子及細胞學的改變引起的主動脈結構及功能的重要變化,這些變化主要包括:主動脈重構的結構改變,表現(xiàn)為管腔的擴大,血管壁X椇竇骯芮患負喂剮偷母謀�。核因祝�

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