本文關(guān)鍵詞：鈣敏感受體在胃癌發(fā)生發(fā)展和十二指腸HCO_3~-分泌中的作用及其機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 鈣敏感受體 離子通道 鈣信號 胃癌 十二指腸碳酸氫鹽分泌

【摘要】：研究背景：鈣是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使,參與了眾多病理生理過程的調(diào)控。G蛋白偶聯(lián)受體C家族的鈣敏感受體(CaSR)作為體內(nèi)鈣平衡重要的調(diào)節(jié)器,在整個消化系統(tǒng)均有表達(dá),并且也在胃腸道生理功能和疾病進(jìn)程中扮演著重要角色。目前有研究報道CaSR能通過鈣信號途徑影響胃酸、胰島素分泌及營養(yǎng)吸收等生理過程；而高鈣飲食可以激活CaSR,不但能抑制結(jié)腸癌的發(fā)展,還可以增加腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性；同時CaSR也在治療腹瀉疾病和結(jié)石相關(guān)性胰腺炎中具有潛在的調(diào)控作用。然而CaSR在胃腸道的功能及調(diào)控機(jī)制仍有很多盲區(qū)。眾所周知消胃腸道腫瘤及消化性潰瘍都是消化系統(tǒng)常見病。胃腸道腫瘤發(fā)病率高,且侵襲、轉(zhuǎn)移能力強(qiáng),多年來人們一直致力消化系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化以及后期浸潤、轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究,但仍有許多問題仍不十分清楚；而消化性潰瘍的復(fù)發(fā)與遷延不愈同樣也是臨床上治療的一個難點。既往研究證實CaSR在不同的腫瘤中作用不同,而消化系統(tǒng)中僅在大腸癌中報道其作為抑癌因素,同時CaSR對胰腺碳酸氫鹽(HCO3-)分泌的促進(jìn)作用提示其可能也參與了十二指腸粘膜屏障的維護(hù),因此本研究希望從消化生理和病理兩方面,探討鈣敏感受體及其下游的鈣信號通路在胃癌發(fā)生發(fā)展及十二指腸碳酸氫鹽分泌中的作用及其相關(guān)機(jī)制,為以鈣敏感受體及離子通道為靶點的藥物研發(fā)提供重要的理論依據(jù)。研究方法：第一部分：鈣敏感受體(CaSR)在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制研究1、采用Real-timePCR、免疫組化及Western-blot技術(shù)檢測胃癌及癌旁組織、正常胃粘膜永生化細(xì)胞系及胃癌細(xì)胞系中CaSR的表達(dá),分析統(tǒng)計CaSR表達(dá)水平和臨床分期、分型、血鈣水平及預(yù)后的相關(guān)性；2、采用CCK8增殖測定實驗、細(xì)胞平面劃痕實驗,Transwell小室侵襲實驗以及裸鼠皮下成瘤實驗從體內(nèi)外水平共同驗證CaSR對胃癌細(xì)胞行為影響；3、動態(tài)離子測定成像系統(tǒng)檢測正常胃粘膜永生細(xì)胞與胃癌細(xì)胞CaSR活化后調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Ca2+及胃酸H+分泌能力的差異,從功能角度揭示CaSR從正常向胃癌發(fā)展中的角色轉(zhuǎn)變；4、Western-bolt技術(shù)檢測正常胃粘膜永生細(xì)胞與胃癌細(xì)胞CaSR活化后下游相關(guān)信號通路變化的差異,篩選最為重要的信號通路及靶基因；5、通過CaSR干擾和過表達(dá)、各種信號通路抑制劑等反向驗證CaSR其下游調(diào)控通路在CaSR促進(jìn)胃癌中的重要作用。第二部分：鈣敏感受體(CaSR)通過Ca2+調(diào)控途徑促進(jìn)十二指腸離子轉(zhuǎn)運及HC03-分泌的研究1、Western-blot和免疫組化技術(shù)檢測CaSR在小鼠十二指腸組織及細(xì)胞系的表達(dá)及分布情況；2、動態(tài)離子測定系統(tǒng)檢測CaSR對十二指腸上皮細(xì)胞內(nèi)Ca2+變化及HC03-分泌的影響；3、通過各種離子通道抑制劑從細(xì)胞水平驗證參與CaSR調(diào)控HC03-分泌的功能機(jī)制及下游相關(guān)通路；4、通過CFTR及KCNQ1基因敲除小鼠和Ussing chamber技術(shù)從體內(nèi)水平證實驗證CaSR調(diào)控HC03-分泌的功能機(jī)制及下游相關(guān)通路。研究結(jié)果：第一部分：鈣敏感受體(CaSR)在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制研究1、Western-blot, Real-time PCR和免疫組化結(jié)果證實CaSR在胃癌組織和胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)明顯高于癌旁組織和正常胃粘膜永生化細(xì)胞系,并且CaSR的表達(dá)量與胃癌大小和分化程度、分期均有相關(guān)性(p0.05)；2、臨床資料統(tǒng)計胃癌病人血液中的鈣離子濃度與CaSR蛋白表達(dá)量呈正相關(guān),生存分析表明CaSR低表達(dá)組的胃癌患者術(shù)后生存時間優(yōu)于CaSR高表達(dá)組(p0.01),提示CaSR與胃癌病人的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)性；3、激活CaSR能促進(jìn)胃癌細(xì)胞MKN45、SGC-7901的增殖、遷移及侵襲能力(P0.05),并且這種促癌能力與CaSR的表達(dá)水平呈正相關(guān)。雖然CaSR對正常胃粘膜永生細(xì)胞GES-1細(xì)胞也有一定的促遷移作用,但對增殖無明顯影響,CaSR的抑制劑NPS2143及CaSR shRNA能逆轉(zhuǎn)CaSR對胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的促進(jìn)作用(p0.05)；4、裸鼠皮下成瘤實驗證實CaCl2瘤內(nèi)注射激活CaSR,可以促進(jìn)裸鼠皮下腫瘤的生長,而CaSR抑制劑NPS2143能夠阻斷CaSR的促成瘤作用(p0.05)；5、功能機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)GES-1正常胃粘膜永生細(xì)胞、MKN45及SGC-7901胃癌細(xì)胞的CaSR均能調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣增加,并且胃癌細(xì)胞MKN45及SGC-7901細(xì)胞內(nèi)鈣升高的幅度較正常胃粘膜永生細(xì)胞GES-1明顯上升,提示正常細(xì)胞與癌細(xì)胞之間CaSR的鈣調(diào)控能力及途徑存在差異(p0.001)；CaSR抑制劑NPS2143及CaSR shRNA能阻斷MKN45胃癌細(xì)胞CaSR活化引起的細(xì)胞內(nèi)鈣變化(p0.05)；6、無外鈣環(huán)境中CaSR的活化并不能引起細(xì)胞內(nèi)鈣變化,必須在有鈣環(huán)境中CaSR才能調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣水平,膜上鈣通道阻斷劑2-APB和PLC途徑阻斷劑均能完全阻斷CaSR對細(xì)胞內(nèi)鈣的影響,提示參與CaSR調(diào)控胃癌細(xì)胞內(nèi)鈣增加的主要機(jī)制是外鈣內(nèi)流途徑(p0.05)；7、分子機(jī)制研究證實,同時激活GES-1正常胃粘膜永生細(xì)胞和MKN45、SGC-7901胃癌細(xì)胞的CaSR,下游MAPK (ERK1/2/JNK)信號通路均在5-10mmin明顯活化,但PI3K/AKT和Wnt/β-catenin通路的變化卻出現(xiàn)了差異,GES-1細(xì)胞的PI3K/AKT和Wnt/β-catenin信號通路被逐漸抑制,而MKN45、SGC-7901細(xì)胞卻明顯活化,提示正常細(xì)胞與癌細(xì)胞之間上述兩條通路的變化存在差異,并且可能與細(xì)胞內(nèi)鈣變化幅度的不同相關(guān)；8、細(xì)胞內(nèi)鈣螯合劑BAPTA-AM能完全阻斷CaSR對PI3K/AKT和Wnt/β-catenin以及MAPK信號通路的活化作用,提示Ca2+信號的確是精確調(diào)控上述通路的關(guān)鍵因素；PI3K/AKT、Wnt/β-catenin的抑制劑和細(xì)胞內(nèi)鈣螯合劑BAPTA-AM均能逆轉(zhuǎn)CaSR促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的能力；9、在GES-1細(xì)胞中過表達(dá)CaSR能明顯上升細(xì)胞內(nèi)鈣水平,進(jìn)而使下游PI3K/AKT和Wnt/β-catenin通路由抑制變?yōu)榛罨?促進(jìn)細(xì)胞的遷移能力(p0.05),進(jìn)一步反向證明CaSR表達(dá)量及其調(diào)控的細(xì)胞內(nèi)鈣變化在胃癌進(jìn)程中的重要作用；10、GES-1正常胃粘膜永生細(xì)胞CaSR的活化能使細(xì)胞內(nèi)pH的恢復(fù)時間明顯縮短,pH回復(fù)曲線斜率增加,提示CaSR在正常情況下是促進(jìn)H+分泌的,但激活胃癌細(xì)胞MKN45及SGC-7901的CaSR后,細(xì)胞內(nèi)pH的恢復(fù)時間明顯延長,pH回復(fù)曲線斜率減小,提示胃癌中CaSR對胃酸的調(diào)控失活或者轉(zhuǎn)變成為抑制作用(p0.05)；第二部分：鈣敏感受體(CaSR)通過Ca2+調(diào)控途徑促進(jìn)十二指腸離子轉(zhuǎn)運及HC03-分泌的研究1、免疫組化及蛋白免疫印跡實驗證實C57BL/6小鼠十二指腸組織、狗的十二指腸上皮細(xì)胞SCBN以及人的大腸癌細(xì)胞SW480、Caco-2均有CaSR表達(dá),十二指腸組織主要在絨毛上皮頂端及基底部廣泛表達(dá),進(jìn)一步亞細(xì)胞定位是在細(xì)胞的胞漿、胞膜區(qū)域；2、功能實驗發(fā)現(xiàn)十二指腸上皮細(xì)胞SCBN的CaSR能夠調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣增加,并且增加的幅度與激動劑的刺激濃度呈劑量依賴性(p0.01)。CaSR阻斷劑Calhex后能明顯阻斷CaSR介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣變化p0.05)；3、無外鈣環(huán)境中激活SCBN細(xì)胞的CaSR并不能引起細(xì)胞內(nèi)鈣增加,必須在有鈣環(huán)境中CaSR才能調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣水平,膜上鈣通道阻斷劑2-APB和SKF能完全阻斷CaSR對SCBN細(xì)胞內(nèi)鈣的影響,提示CaSR對SCBN細(xì)胞的鈣調(diào)控機(jī)制是通過外鈣內(nèi)流途徑是p0.05)；4、進(jìn)一步單細(xì)胞HC03-動態(tài)測定實驗發(fā)現(xiàn)SCBN細(xì)胞的CaSR可以通過影響細(xì)胞內(nèi)鈣變化,調(diào)控HC03-分泌通道CFTR的開放促進(jìn)了HC03-的跨膜流動,CFTR阻斷劑CFTR-173及膜上Ca2+通道阻斷劑2-APB均能阻斷CaSR對HC03-跨膜流動的促進(jìn)作用p0.01)；5、動物體內(nèi)實驗結(jié)果提示CaSR的活化對CFTR野生型小鼠的十二指腸粘膜HC03-分泌具有促進(jìn)作用(p0.01),但對CFTR敲除小鼠HCO3-的分泌沒有影響,另外對代表C1-通道活性的Isc值也沒有調(diào)控作用(p0.05)；PLC-Ca2+途經(jīng)抑制劑U73122可以明顯阻斷CaSR對CFTR野生型小鼠HCO3-的促分泌作用(p0.01)；6、體內(nèi)實驗進(jìn)一步證實鈣激活鉀通道(IKCa)抑制劑clotrimazole和膜上通道抑制劑2-APB均能明顯的抑制CaSR對小鼠十二指腸粘膜HC03-分泌的促進(jìn)作用(p0.05),而cAMP激活鉀通道(KCNQ1)抑制劑;hromanol293B卻沒有影響(p0.05),KCNQ1野生及敲除型小鼠CaSR活化后對HC03-的分泌調(diào)控沒有明顯差異(p0.05)；7、CaSR介導(dǎo)的鈣調(diào)控途徑僅對十二指腸HC03-分泌有促進(jìn)作用,而對另一個陰離子C1-通道的分泌沒有影響。研究結(jié)論：1、本研究首次證實了CaSR在胃癌發(fā)生發(fā)展中的促癌作用及其相關(guān)機(jī)制,CaSR通過膜上鈣通道介導(dǎo)了胃癌細(xì)胞內(nèi)鈣的增加,進(jìn)而激活下游的PI3K/AKT和β-catenin信號通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力。并且CaSR的表達(dá)水平及其介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣變化幅度是調(diào)控胃癌細(xì)胞行為及其下游信號通路活化差異的重要因素。我們的結(jié)果不僅為臨床上高鈣血癥的不良預(yù)后給出了可能的解釋,同時也為低鈣補(bǔ)液、低鈣飲食防治胃癌的理論和以CaSR為靶點的藥物研發(fā)提供實驗依據(jù)；2、我們生理功能的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)CaSR具有促進(jìn)十二指腸HCO3-的分泌、幫助粘液屏障構(gòu)建的重要作用。十二指腸上皮細(xì)胞的CaSR通過鈣調(diào)控途徑,不僅激活了HCO3-分泌通道CFTR,同時還活化了為HCO3-分泌提供驅(qū)動力IKCa(Ca2+激活鉀通道)通道共同促進(jìn)HCO3-的分泌,而C1-通道沒有受CaSR/Ca2+途徑的調(diào)控,推測十二指腸上皮HCO3-與C1-的分泌存在不同的調(diào)節(jié)機(jī)制。該研究不僅有助于治療囊性纖維化病人HCO3-的分泌缺失,還可能為以CaSR和離子通道為靶點的粘膜屏障促進(jìn)藥物提供一定的理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：鈣敏感受體 離子通道 鈣信號 胃癌 十二指腸碳酸氫鹽分泌
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.2
【目錄】：

• 縮略詞表6-8
• Abstract8-12
• 中文摘要12-17
• 第一部分 鈣敏感受體在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制研究17-120
• 第一章 前言17-19
• 第二章 鈣敏感受體在人胃癌組織及胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)變化19-43
• 2.1 實驗材料19-24
• 2.2 實驗方法24-32
• 2.3 結(jié)果32-40
• 2.4 討論40-42
• 2.5 小結(jié)42-43
• 第三章 鈣敏感受體對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響43-72
• 3.1 實驗材料43-45
• 3.2 實驗方法45-52
• 3.3 實驗結(jié)果52-69
• 3.4 討論69-71
• 3.5 小結(jié)71-72
• 第四章 鈣敏感受體促進(jìn)胃癌的機(jī)制研究72-116
• 第一節(jié) 功能機(jī)制研究：正常胃粘膜永生細(xì)胞及胃癌細(xì)胞鈣敏感受體調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)變化及H~+分泌的功能存在差異74-86
• 4.1 實驗材料74-77
• 4.2 實驗方法77-80
• 4.3 實驗結(jié)果80-86
• 第二節(jié) 分子機(jī)制研究：正常胃粘膜永生細(xì)胞及胃癌細(xì)胞鈣敏感受體活化調(diào)控下游信號通路活化的差異86-116
• 4.1 實驗材料86-89
• 4.2 實驗方法89-91
• 4.3 實驗結(jié)果91-109
• 4.4 討論109-115
• 4.5 小結(jié)115-116
• 參考文獻(xiàn)116-120
• 第二部分 鈣敏感受體通過Ca~(2+)調(diào)控途徑促進(jìn)十二指腸離子轉(zhuǎn)運及碳酸氫鹽分泌的研究120-173
• 第一章 前言120-123
• 第二章 鈣敏感受體在十二指腸組織及細(xì)胞系的表達(dá)分布123-135
• 2.1 實驗材料123-126
• 2.2 實驗方法126-130
• 2.3 實驗結(jié)果130-133
• 2.4 討論133-134
• 2.5 小結(jié)134-135
• 第三章 十二指腸上皮細(xì)胞的鈣敏感受體具有調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)變化的功能135-148
• 3.1 實驗材料135-138
• 3.2 實驗方法138-139
• 3.3 結(jié)果139-145
• 3.4 討論145-147
• 3.5 小結(jié)147-148
• 第四章 鈣敏感受體通過Ca~(2+)調(diào)控途徑促進(jìn)了十二指腸離子轉(zhuǎn)運及碳酸氫鹽分泌148-169
• 第一節(jié) 細(xì)胞水平驗證鈣敏感受體活化對十二指腸上皮細(xì)胞SCBN碳酸氫跨膜流動的促進(jìn)作用149-156
• 4.1 實驗材料149-151
• 4.2 實驗方法151-153
• 4.3 結(jié)果153-156
• 第二節(jié) 體內(nèi)實驗證實鈣敏感受體對十二指腸上皮細(xì)胞SCBN碳酸氫分泌的促進(jìn)作用156-169
• 4.1 實驗材料156-158
• 4.2 實驗方法158-160
• 4.3 實驗結(jié)果160-165
• 4.4 討論165-168
• 4.5 小結(jié)168-169
• 參考文獻(xiàn)169-173
• 文獻(xiàn)綜述173-181
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的論文、申請的基金及專利181-182
• 致謝182

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本文編號：833633