本文關(guān)鍵詞：角膜上皮抗真菌免疫過(guò)程中TLR2對(duì)NOD2的調(diào)控及NOD2的作用

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【摘要】：真菌性角膜炎(fungal keratitis, FK)是導(dǎo)致視力損傷甚至失明的重要原因。在全球范圍內(nèi),約65%的角膜潰瘍是由真菌性角膜炎引起的。在農(nóng)業(yè)國(guó)家如中國(guó)和印度,角膜創(chuàng)傷是誘發(fā)真菌性角膜炎的主要原因。角膜創(chuàng)傷可以將真菌孢子直接帶入角膜基質(zhì)層,也可以通過(guò)破壞角膜上皮屏障的方式導(dǎo)致角膜直接暴露在致病性真菌前。其他誘因還包括免疫功能低下、皮質(zhì)類固醇使用史和角膜接觸鏡的佩戴。鐮刀菌屬和曲霉菌屬是導(dǎo)致真菌性角膜炎最主要的兩類病原體。大面積潰瘍,前房積膿和曲霉菌感染往往是導(dǎo)致治療失敗的原因。此外,以往的研究表明,在曲霉菌性角膜炎患者中,42-60%需要進(jìn)行角膜移植術(shù),而相比之下,鐮刀菌性角膜炎患者僅有23-32%需要進(jìn)行角膜移植術(shù)。因此在本研究中,我們選擇了煙曲霉菌(Aspergillus fumigates)作為角膜感染模型的病原體,具有重要的臨床意義。哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在多種模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors, PRRs),其中包括toll樣受體(toll-like receptors, TLR)和核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(NOD)樣受體(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors, NLRS)。PRRs通過(guò)識(shí)別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)級(jí)聯(lián)傳導(dǎo),進(jìn)而啟動(dòng)天然免疫。TLRs位于細(xì)胞膜上,其家族中的TLR2可以識(shí)別包括酵母聚糖(zymosan, Zym)在內(nèi)的多種配體(除TLR2外,酵母聚糖還可被Dectin-1識(shí)別);NLRs位于細(xì)胞內(nèi),其家族中的NOD2可識(shí)別肽聚糖(peptidoglycan, PGN)的衍生物胞壁酰二肽(muramyl dipeptide, MDP),而PGN是革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌的組分之一。在識(shí)別配體后,NOD2和TLR2均可通過(guò)核轉(zhuǎn)錄因子κB (NFκB)信號(hào)通路引起炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。在上述過(guò)程中,受體相互作用蛋白2 (receptor interacting protein 2, RIP2)是NOD2信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵分子：NOD2與RIP2結(jié)合使后者與IκB激酶(inhibitory κB kinase, IKK)的亞基IKKγ相互作用,導(dǎo)致IKK復(fù)合物激活。IKK復(fù)合物使IκB-α泛素化降解,釋放出的游離NFκB轉(zhuǎn)位入核進(jìn)而激活下游通路。已有文獻(xiàn)證實(shí)TLR2和NOD 2在角膜上皮細(xì)胞中有基礎(chǔ)表達(dá)；我們?cè)陬A(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),加熱滅活的煙曲霉菌孢子可以提高TLR2和NOD2的表達(dá)。以往的研究還證實(shí),TLR2在煙曲霉菌性角膜炎中起重要作用,其活化能激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,促進(jìn)炎性因子如白介素(interleukin, IL)-6、IL-8、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α等的產(chǎn)生。鑒于TLR2和NOD2均能激活NFκB信號(hào)傳導(dǎo)途徑,我們意圖揭示TLR2和NOD2在永生化人角膜上皮細(xì)胞(human corneal epithelial cells, HCECs)抗煙曲霉菌的過(guò)程中是否存在交叉對(duì)話；NOD2在HCECs抗煙曲霉菌免疫過(guò)程中是否發(fā)揮作用。我們的研究結(jié)果表明,酵母聚糖可通過(guò)依賴TLR2的途徑增加NOD2的表達(dá)；使用酵母聚糖預(yù)處理可以減少M(fèi)DP引起的炎性細(xì)胞因子的分泌。此外,煙曲霉菌孢子也通過(guò)部分依賴TLR2的方式促進(jìn)NOD2和RIP2的表達(dá)。使用小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA)敲除NOD2后,煙曲霉菌孢子引起的炎性因子分泌減少。上述結(jié)果有助于我們加深對(duì)真菌性角膜炎天然免疫機(jī)制的了解,揭示了NOD2在真菌性角膜炎中的作用,為真菌性角膜炎的治療指出新的研究方向。第一部分NOD2在HCECs中的表達(dá)[目的]研究NOD2在HCECs中的基礎(chǔ)表達(dá),及NOD2配體MDP、煙曲霉菌對(duì)NOD2表達(dá)的影響。[方法]1.細(xì)胞的獲取和培養(yǎng)：HCECs由韋恩州立大學(xué)的Fu-Shin X.Yu教授慷慨提供。細(xì)胞在37℃、含5%CO2的濕潤(rùn)的細(xì)胞溫箱中孵育。細(xì)胞培養(yǎng)基采用新生牛血清的改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM)/F12與不含血清的角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基(keratinocyte serum free medium, KSFM)按照1：1的比例配制而成。細(xì)胞以1×105個(gè)／孔的濃度接種于6孔微培養(yǎng)板上,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.煙曲霉菌菌株的獲取和孢子的制備：煙曲霉菌菌株CCTCC 93024購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。將菌種接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上,37℃條件下培養(yǎng)4天。輕柔刮取培養(yǎng)基表面的孢子并在含0.05% Tween 80的PBS(phosphate-buffered saline)中制備成孢子混懸液。使用四層無(wú)菌紗布過(guò)濾該混懸液以達(dá)到去除煙曲霉菌菌絲和其他殘留物,提純孢子的目的。取過(guò)濾后的孢子混懸液,56℃加熱60min使孢子失活,使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),稀釋制成1×105/ml的孢子混懸液。3.細(xì)胞的刺激：使用滅活的煙曲霉菌孢子(1×105/m1)刺激HCECs,經(jīng)12h或24h后收取細(xì)胞,熒光定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(real time-polymerase chain reaction, RT-PCR)和western blotting檢測(cè)TLR2、NOD2的水平。使用NOD2的配體MDP(10μg/ml)刺激HCECs,經(jīng)12h或24h后收取細(xì)胞及培養(yǎng)上清,RT-PCR和western blotting檢測(cè)NOD2及下游關(guān)鍵分子RIP2、NFκB-p65和IκB-α的表達(dá)水平,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)IL-6、IL-8和TNF-α的分泌,免疫熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子NFκB-p65向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移。[結(jié)果]1. HCECs中TLR2與NOD2的mRNA和蛋白水平均在接受煙曲霉菌孢子刺激后有所提高。2.使用MDP刺激HCECs后,NOD2及其下游關(guān)鍵分子RIP2、NFKB-p65和IκB-α表達(dá)均升高,NFκB-p65轉(zhuǎn)位入核增多,IL-6、IL-8和TNF-α分泌增加。[結(jié)論]1.煙曲霉菌孢子可以上調(diào)HCECs中TLR2與NOD2的表達(dá)。2.MDP可以激活NOD2及下游NFκB通路,提高炎性細(xì)胞因子的分泌水平。于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.煙曲霉菌菌株的獲取和孢子的制備：煙曲霉菌菌株CCTCC 93024購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。將菌種接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上,37℃條件下培養(yǎng)4天。輕柔刮取培養(yǎng)基表面的孢子并在含0.05% Tween 80的PBS(phosphate-buffered saline)中制備成孢子混懸液。使用四層無(wú)菌紗布過(guò)濾該混懸液以達(dá)到去除煙曲霉菌菌絲和其他殘留物,提純孢子的目的。取過(guò)濾后的孢子混懸液,56℃加熱60min使孢子失活,使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),稀釋制成1×105/ml的孢子混懸液。3.細(xì)胞的刺激：使用滅活的煙曲霉菌孢子(1×105/m1)刺激HCECs,經(jīng)12h或24h后收取細(xì)胞,熒光定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(real time-polymerase chain reaction, RT-PCR)和western blotting檢測(cè)TLR2、NOD2的水平。使用NOD2的配體MDP(10μg/ml)刺激HCECs,經(jīng)12h或24h后收取細(xì)胞及培養(yǎng)上清,RT-PCR和western blotting檢測(cè)NOD2及下游關(guān)鍵分子RIP2、NFκB-p65和IκB-α的表達(dá)水平,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)IL-6、IL-8和TNF-α的分泌,免疫熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子NFκB-p65向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移。[結(jié)果]1. HCECs中TLR2與NOD2的mRNA和蛋白水平均在接受煙曲霉菌孢子刺激后有所提高。2.使用MDP刺激HCECs后,NOD2及其下游關(guān)鍵分子RIP2、NFKB-p65和IκB-α表達(dá)均升高,NFκB-p65轉(zhuǎn)位入核增多,IL-6、IL-8和TNF-α分泌增加。[結(jié)論]1.煙曲霉菌孢子可以上調(diào)HCECs中TLR2與NOD2的表達(dá)。2.MDP可以激活NOD2及下游NFκB通路,提高炎性細(xì)胞因子的分泌水平。第二部分TLR2對(duì)NOD2在HCECs抗煙曲霉菌免疫中的表達(dá)和下游通路的影響[目的]研究單純使用TLR2配體酵母聚糖刺激HCECs對(duì)NOD2表達(dá)的影響,并驗(yàn)證上述影響是否通過(guò)TLR2發(fā)揮作用。研究酵母聚糖預(yù)處理對(duì)NOD2配體MDP、煙曲霉菌引起的NOD2通路激活的影響。[方法]1.細(xì)胞的刺激：使用不同濃度的酵母聚糖和經(jīng)熱堿處理過(guò)的酵母聚糖(10μg/ml,僅能被Dectin-1識(shí)別)分別刺激HCECs,經(jīng)12h或24h后收取細(xì)胞,RT-PCR和western blotting檢測(cè)NOD2、RIP2的水平。使用不同濃度的酵母聚糖預(yù)處理HCECs 12h后,更換細(xì)胞培養(yǎng)液,37℃條件下MDP (10μg/ml)刺激12h或24 h,收取細(xì)胞和培養(yǎng)上清,RT-PCR和western blotting檢測(cè)NOD2、RIP2的表達(dá)水平,ELISA檢測(cè)IL-6、IL-8和TNF-α的分泌。2.抗體阻斷：HCECs與抗人TLR2(100 μg/ml)單克隆抗體共孵育4h后,更換培養(yǎng)液,37℃條件下滅活的煙曲霉菌孢子(1×10S/m1)刺激12 h或24 h,收取細(xì)胞及培養(yǎng)上清,RT-PCR和western blotting檢測(cè)NOD2.RIP2的表達(dá)水平,ELISA檢測(cè)IL-6、IL-8和TNF-α的分泌,免疫熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子NFκB-p65向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移。3.RNA干擾：利用GenBank庫(kù)查找NOD2 DNA中的三組目的序列,針對(duì)這三組序列,使用WI siRNA篩選程序(WI siRNAselection program)制作三條NOD2siRNA和一條用作對(duì)照的scramble siRNA(隨機(jī)打亂序列的RNA)。將細(xì)胞接種于6孔微培養(yǎng)板上,當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到50-60%時(shí),每孔使用50nM siRNA,通過(guò)Lipofectamine 2000試劑在Opti-MEM減血清培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6h和12h后收取細(xì)胞使用RT-PCR和western blotting檢測(cè)NOD2及下游RIP2表達(dá)情況,確定敲減效果。選取敲減效果最佳的一條siRNA,轉(zhuǎn)染HCECs 4h后,更換細(xì)胞培養(yǎng)液,37℃條件下滅活的煙曲霉菌孢子(1×105/m1)刺激24 h,收取培養(yǎng)上清,ELISA檢測(cè)IL-6、IL-8和TNF-a的分泌。[結(jié)果]1.酵母聚糖刺激HCECs的最佳濃度是10μg/ml。該濃度的酵母聚糖刺激可有效提高HCECs中NOD2與RIP2的mRNA和蛋白水平,該作用可被TLR2抗體阻斷。經(jīng)熱堿處理過(guò)的酵母聚糖沒(méi)有這種作用。2.酵母聚糖預(yù)處理HCECs的最佳濃度是10ng/ml。與單純使用MDP刺激相比,使用該濃度的酵母聚糖預(yù)處理后,MDP引起NOD2、RIP2表達(dá)提高的能力下降,IL-6、IL-8和TNF-α的分泌減少。3.使用抗體阻斷TLR2后,滅活的煙曲霉菌孢子引起NOD2及其下游關(guān)鍵分子RIP2、NFκB-p65和IκB-α表達(dá)升高的能力下降,NFκB-p65轉(zhuǎn)位入核減少,但仍高于空白對(duì)照組。4. NOD2 siRNA可有效降低NOD2和RIP2的表達(dá)。敲減NOD2后,滅活的煙曲霉菌孢子刺激HCECs產(chǎn)生的IL-6、IL-8和TNF-P減少,但仍多于空白對(duì)照組。[結(jié)論]1.酵母聚糖可以通過(guò)依賴TLR2的途徑上調(diào)HCECs中NOD2與RIP2的表達(dá)。2.酵母聚糖預(yù)處理可能引起細(xì)胞的“交叉耐受”,即TLR2配體激發(fā)了細(xì)胞耐受性,降低了細(xì)胞對(duì)NOD2配體的反應(yīng),從而使得后續(xù)MDP處理引起NOD2、 RIP2表達(dá)提高的能力下降,炎性細(xì)胞因子分泌減少。3.與酵母聚糖相似,煙曲霉菌孢子也通過(guò)部分依賴TLR2的途徑上調(diào)HCECs中NOD2的表達(dá),激活其下游通路。4. siRNA可成功敲減NOD2。在煙曲霉菌孢子刺激HCECs分泌炎性細(xì)胞因子的過(guò)程中,NOD2發(fā)揮了部分作用。
【關(guān)鍵詞】：核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白2 胞壁酰二肽 煙曲霉菌 永生化人角膜上皮細(xì)胞 炎性細(xì)胞因子 核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白2 Toll樣受體2 酵母聚糖 煙曲霉菌 永生化人角膜上皮細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R772.2
【目錄】：

• 中文摘要6-11
• 英文摘要11-17
• 符號(hào)說(shuō)明17-22
• 第一部分 NOD2在HCECs中的表達(dá)22-48
• 前言22-23
• 材料和方法23-39
• 結(jié)果39
• 討論39-41
• 結(jié)論41-42
• 附圖表42-44
• 參考文獻(xiàn)44-48
• 第二部分 TLR2對(duì)NOD2在HCECs抗煙曲霉菌免疫中的表達(dá)和下游通路的影響48-87
• 前言48-49
• 材料和方法49-67
• 結(jié)果67-70
• 討論70-73
• 結(jié)論73-75
• 附圖表75-81
• 參考文獻(xiàn)81-87
• 致謝87-88
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文88-89
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況89-90
• 外文論文190-114
• 外文論文2114-125

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 王麗婭;楊子建;張?jiān)虑?趙麗娜;;河南地區(qū)真菌性角膜炎病因?qū)W及流行病學(xué)分析[J];中國(guó)實(shí)用眼科雜志;2006年03期

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本文編號(hào)：822766