發(fā)布時(shí)間：2017-09-07 03:18

  本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)錄因子AIOLOS在急性B淋巴細(xì)胞白血病中的表達(dá)及其功能的研究

  更多相關(guān)文章： AIOLOS B-ALL PI3K/Akt信號(hào)通路 凋亡 細(xì)胞周期

【摘要】：研究背景：急性淋巴細(xì)胞細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)是兒童時(shí)期最常見(jiàn)的惡性疾病,占15歲兒童惡性腫瘤的25%。近年來(lái),兒童白血病的發(fā)病率呈上升趨勢(shì),我國(guó)10歲以下兒童白血病發(fā)病率為3/10萬(wàn)-4/10萬(wàn)。兒童ALL中,約85%為B系淋巴細(xì)胞白血病(B lineage acute lymphoblastic leukemia, B-ALL),剩余15%為T系淋巴細(xì)胞白血病。盡管聯(lián)合化療方案和治療策略的改善使得ALL患兒的生存率明顯提高,但是仍有20%-30%的患兒不能完全緩解或復(fù)發(fā)而導(dǎo)致死亡,因此我們需要進(jìn)一步探尋ALL的發(fā)病機(jī)制。B-ALL是以未成熟B淋巴細(xì)胞克隆性擴(kuò)增為特點(diǎn)的惡性腫瘤,多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在這一進(jìn)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用,尤其是調(diào)控淋巴細(xì)胞發(fā)育和成熟等基因的異常表達(dá),可能在B-ALL發(fā)病過(guò)程中扮演了重要角色。含有鋅指結(jié)構(gòu)的IKAROS蛋白家族就是其中一類重要的調(diào)控因子,作為第二個(gè)被發(fā)現(xiàn)的IKAROS家族成員,轉(zhuǎn)錄因子AIOLOS在B淋巴細(xì)胞分化、增殖及成熟過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn),AIOLOS表達(dá)缺失會(huì)導(dǎo)致前B細(xì)胞和未成熟B細(xì)胞增多,而成熟的B細(xì)胞顯著減少。而且,Aiolos缺失突變小鼠的B細(xì)胞處于高增殖狀態(tài),血清內(nèi)抗體水平升高,進(jìn)而促進(jìn)自身抗體和淋巴瘤的發(fā)生,說(shuō)明AIOLOS具有腫瘤抑制作用。臨床研究證明AIOLOS的異常表達(dá)與成人B-ALL、慢性淋巴細(xì)胞白血病有關(guān),在某些淋巴瘤病例中也發(fā)現(xiàn)了AIOLOS的異常表達(dá)。然而,AIOLOS在兒童B-ALL中的作用尚不明確,而且AIOLOS對(duì)白血病細(xì)胞發(fā)揮作用的機(jī)制也有待進(jìn)一步研究。目的：1.檢測(cè)AIOLOS在兒童B-ALL中的表達(dá),初步了解AIOLOS在ALL發(fā)生發(fā)展中的作用。2.構(gòu)建AIOLOS的慢病毒過(guò)表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染Nalm-6細(xì)胞,為研究AIOLOS在ALL中的作用建立基礎(chǔ)。3.研究AIOLOS過(guò)表達(dá)對(duì)白血病細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。4.闡明AIOLOS影響白血病細(xì)胞生物學(xué)行為的作用機(jī)制。方法：1. AIOLOS在B-ALL兒童骨髓白血病細(xì)胞及白血病細(xì)胞系中表達(dá)水平的檢測(cè)1.1收集36例B-ALL患兒及6例健康志愿者的骨髓標(biāo)本,密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞,免疫磁珠分選CD19+的B淋巴細(xì)胞,采用RT-PCR及實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)AIOLOS mRNA的表達(dá)水平。1.2以白血病細(xì)胞系Ball-1、Nalm-6、Jurkat、Molt-4和K562為研究對(duì)象,以健康兒童B淋巴細(xì)胞為對(duì)照,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blotting法分別檢測(cè)AIOLOS在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。2. AIOLOS慢病毒過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)鑒定2.1通過(guò)RT-PCR方法從健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞中獲得AIOLOS基因全長(zhǎng),經(jīng)EcoR Ⅰ和Mlu Ⅰ雙酶切后,將AIOLOS基因片段與慢病毒表達(dá)載體pWPT-PURO-GFP連接重組為pWPT-PURO-AIOLOS。通過(guò)4質(zhì)粒系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝,并以稀釋滴定法測(cè)定病毒滴度。2.2慢病毒感染B-ALL細(xì)胞系Nalm-6后,采用流式細(xì)胞術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blotting法檢測(cè)AIOLOS細(xì)胞中的表達(dá)。ENalm-6過(guò)表達(dá)對(duì)3. AIOLOS細(xì)胞生物學(xué)行為的影響Nalm-63.1將細(xì)胞分為三組：實(shí)驗(yàn)組,即Nalm-6過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組,稱為AIOLOS陰性對(duì)照組,即空載體轉(zhuǎn)染組,稱為Nalm-6-AIOLOS;空白Nalm-6-Mock;對(duì)照組,即未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,稱為Nalm-63.2細(xì)胞增殖：采用CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Nalm-6-Control。細(xì)胞的吸光度值,并繪制7-11 d Nalm-6增殖曲線。3.3細(xì)胞周期分布：利用碘化丙啶(PI)染色后,以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞Nalm-6的細(xì)胞周期分布。3.4細(xì)胞凋亡：采用Annexin V與PI雙染法,以流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡。3.5細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性檢測(cè)：經(jīng)不同濃度的長(zhǎng)春新堿(VCR)或柔紅霉素(DNR)作用24h后,以CCK-8法檢測(cè)三組細(xì)胞的吸光度值,并計(jì)算各化療藥物的IC50值。3.6細(xì)胞侵襲能力：以Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Nalm-6細(xì)胞的侵襲能力；Nalm-6細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS-5共培養(yǎng)48 h后,應(yīng)用Matrigel管狀形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HS-5細(xì)胞的體外血管新生能力。4. AIOLOS過(guò)表達(dá)影響Nalm-6細(xì)胞生物學(xué)行為的機(jī)制研究4.1細(xì)胞周期與凋亡相關(guān)基因和蛋白的檢測(cè)：以實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)三組細(xì)胞中BCL-2、BAX、P27、CyclinD3、C-MYC基因的表達(dá)；以Western blotting法檢測(cè)三組細(xì)胞中BCL-2、P27、CyclinD3蛋白的表達(dá)。4.2血管生成相關(guān)基因的檢測(cè)：以實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)三組細(xì)胞中VEGF、 PLGF和ANG1基因的表達(dá);4.3微陣列芯片檢測(cè)及基因芯片數(shù)據(jù)分析：應(yīng)用人類全基因組芯片,篩選Nalm-6-AIOLOS細(xì)胞與Nalm-6-Mock細(xì)胞之間的差異表達(dá)基因；并基于DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO聚類和KEGG通路分析。4.4 PI3K/Akt信號(hào)通路：使用FlowCellect PI3K/MAPK Dual Pathway Activation Detection Kit,以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)三組細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路的活化情況。4.5 Akt抑制劑對(duì)Nalm-6-AIOLOS細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響：實(shí)驗(yàn)分為Nalm-6-AIOLOS、Nalm-6-Mock、Nalm-6-Control及Nalm-6-AIOLOS+Akt抑制劑四組,以Western blotting法檢測(cè)四組細(xì)胞中Akt、磷酸化Akt (pAkt)蛋白的表達(dá)量；細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)四組細(xì)胞增殖,并繪制生長(zhǎng)曲線；利用PI染色后,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞周期分布；采用Annexin V與PI雙染法,以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡。結(jié)果：1. AIOLOS在B-ALL兒童骨髓白血病細(xì)胞及白血病細(xì)胞系中的表達(dá)水平1.1正常兒童B淋巴細(xì)胞中AIOLOS基因主要有三種亞型,分別為AIO1、AlO2和AIO5。B-ALL患兒中AIOLOS基因的亞型分布與正常組無(wú)明顯差別。所有標(biāo)本中,A101亞型的表達(dá)頻率最高。B-ALL患兒組AIOLOS基因的表達(dá)水平較健康兒童低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但AIOLOS的表達(dá)水平與患兒性別、免疫分型和危險(xiǎn)度分組無(wú)明顯關(guān)聯(lián)(P0.05)。1.2 B-ALL細(xì)胞系Nalm-6中AIOLOS mRNA的表達(dá)水平較正常B淋巴細(xì)胞低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),相應(yīng)地,Nalm-6細(xì)胞中AIOLOS蛋白表達(dá)水平也較正常組低(P0.05)。2. AIOLOS慢病毒過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)鑒定成功構(gòu)建了pWPT-PURO-AIOLOS'慢病毒表達(dá)載體,測(cè)序鑒定結(jié)果與AIOLOS基因序列一致。在293T細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝獲得的病毒滴度為3.23×108TU/ml,滿足實(shí)驗(yàn)要求。當(dāng)感染復(fù)數(shù)(MOI)為100時(shí),Nalm-6細(xì)胞感染率可達(dá)90%以上。轉(zhuǎn)染后的Nalm-6細(xì)胞,AIOLOS在mRNA和蛋白水平表達(dá)均明顯上調(diào)(P0.05)。3. AIOLOS過(guò)表達(dá)對(duì)Nalm-6細(xì)胞生物學(xué)行為的影響3.1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示Nalm-6-AIOLOS細(xì)胞的增殖速度明顯慢于Nalm-6-Control和Nalm-6-Mock (P0.05)。3.2與Nalm-6-Control細(xì)胞相比,AIOLOS過(guò)表達(dá)后,Nalm-6細(xì)胞在G0/G1期的比例由70.4%±2.39%升至84.1%±2.18%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而處于S期和G2/M期的細(xì)胞則分別由20.3%±0.94%和7.3%±0.81%(Nalm-6-Control)降至11.7%±0.78%和2.2%±0.56%(Nalm-6-AIOLOS),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)= Nalm-6-Control與Nalm-6-Mock在各細(xì)胞周期的比例無(wú)明顯差異(P0.05)。3.3 Nalm-6-AIOLOS、Nalm-6-Mock與Nalm-6-Control總凋亡細(xì)胞比例分別為10.55%±0.67%,16.87%±0.52%,18.13%±0.51%, Nalm-6-AIOLOS組細(xì)胞凋亡較另外兩組細(xì)胞凋亡明顯減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；其中,與Nalm-6-Control細(xì)胞(7.86%±0.52%)相比,Nalm-6-AIOLOS細(xì)胞的晚期凋亡比例(2.83%±0.67%)明顯減少(P0.05)。3.4三組細(xì)胞對(duì)VCR或DNR的敏感性無(wú)明顯差異。相比于Nalm-6-Control, Nalm-6-AIOLOS細(xì)胞對(duì)VCR和DNR 24 h的IC50值分別為19.91 ng/ml (vs. 18.44 ng/ml)和3.62 ng/ml (vs.3.22 ng/ml),差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.5 Tranwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中,Nalm-6-AIOLOS與Nalm-6-Control在450nm波長(zhǎng)處的吸光度值分別為0.11±0.05和0.14±0.06,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。體外血管新生實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與Nalm-6-AIOLOS共培養(yǎng)后,HS-5細(xì)胞的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)形成較另外兩組增多。4. AIOLOS過(guò)表達(dá)影響Nalm-6細(xì)胞生物學(xué)行為的機(jī)制研究4.1與Nalm-6-Control目比,Nalm-6-AIOLOS細(xì)胞中BCL-2基因表達(dá)明顯上調(diào)(P0.05), BAX和CyclinD3基因表達(dá)明顯下調(diào)(P0.05),而C-MYC和P27基因表達(dá)變化不大(P0.05); BCL-2與P27蛋白在三組細(xì)胞中的表達(dá)量相差不大(P0.05),CyclinD3蛋白在Nalm-6-AIOLOS細(xì)胞中的表達(dá)量明顯低于在另外兩組細(xì)胞中的表達(dá)量(P0.05)。4.2與Nalm-6-Control組細(xì)胞相比,Nalm-6-AIOLOS組細(xì)胞的VEGF、PLGF和ANG1基因表達(dá)均上調(diào)了2倍以上(P0.05)。4.3基因芯片共篩選出差異表達(dá)基因278個(gè),其中,Nalm-6-AIOLOS組細(xì)胞表達(dá)上調(diào)基因102個(gè),表達(dá)下調(diào)基因176個(gè);差異表達(dá)基因涉及的GO分類主要有生物學(xué)調(diào)控、代謝過(guò)程、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、結(jié)合、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性等；差異表達(dá)基因涉及的KEGG通路主要有Pancreatic secretion、Neuroactive ligand-receptor interaction、 Small cell lung cancer、Melanoma等 。4.4流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示Nalm-6-AIOLOS中pAkt陽(yáng)性細(xì)胞比例較Nalm-6-Mock與Nalm-6-Control組細(xì)胞明顯增多(P0.05)。Western blotting結(jié)果顯示,Akt蛋白在三組細(xì)胞中的表達(dá)并無(wú)明顯差異,然而,Nalm-6-AIOLOS組細(xì)胞pAkt蛋白卻明顯高于另外兩組(P0.05)。另外,給予Akt抑制劑處理后,Nalm-6-AIOLOS組細(xì)胞Akt蛋白的表達(dá)無(wú)明顯改變,但pAkt蛋白明顯下調(diào)(P0.05)。4.5 Akt抑制劑可有效增加Nalm-6-AIOLOS田胞的凋亡比例,但對(duì)Nalm-6-AIOLOS細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期分布無(wú)明顯影響。結(jié)論：1. B-ALL兒童白血病細(xì)胞中AIOLOS基因的表達(dá)水平減低;2. AIOLOS過(guò)表達(dá)抑制了Nalm-6細(xì)胞的增殖,將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期,同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡；3. AIOLOS過(guò)表達(dá)主要通過(guò)CyclinD3依賴性的信號(hào)通路抑制Nalm-6細(xì)胞的增殖與細(xì)胞周期,而通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路的活化促進(jìn)細(xì)胞存活。
【關(guān)鍵詞】：AIOLOS B-ALL PI3K/Akt信號(hào)通路 凋亡 細(xì)胞周期
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R733.71
【目錄】：

• 中文摘要6-12
• 英文摘要12-19
• 符號(hào)說(shuō)明19-21
• 前言21-24
• 第一部分 AIOLOS在B-ALL兒童骨髓白血病細(xì)胞及白血病細(xì)胞系中的表達(dá)24-40
• 材料和方法24-34
• 結(jié)果34-35
• 討論35-40
• 第二部分 AIOLOS過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定40-57
• 材料和方法40-51
• 結(jié)果51-53
• 討論53-57
• 第三部分 AIOLOS過(guò)表達(dá)對(duì)Nalm-6細(xì)胞生物學(xué)行為的影響57-67
• 材料與方法57-61
• 結(jié)果61-63
• 討論63-67
• 第四部分 AIOLOS過(guò)表達(dá)影響Nalm-6細(xì)胞生物學(xué)行為的機(jī)制研究67-79
• 材料與方法67-72
• 結(jié)果72-74
• 討論74-79
• 結(jié)論79-80
• 附圖表80-100
• 參考文獻(xiàn)100-114
• 綜述114
• 參考文獻(xiàn)118-114
• 致謝114-124
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄124-125
• 附英文論文125-188
• 附件188

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

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本文編號(hào)：807101