發(fā)布時(shí)間：2017-09-06 16:13

  本文關(guān)鍵詞：SET介導(dǎo)的人乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的體內(nèi)外研究

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【摘要】：背景乳腺癌是女性當(dāng)中一種常見的惡性腫瘤,近年來,我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì),已位居大城市女性惡性腫瘤發(fā)病率的首位。乳腺癌是一種全身性疾病,乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展是由多因素、多步驟協(xié)同作用的復(fù)雜過程,如物理因素、化學(xué)因素、基因突變、染色體異常等。生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子以及激素等生物活性物質(zhì)參與了乳腺細(xì)胞癌變以及轉(zhuǎn)移的過程,這些活性物質(zhì)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)生異常,可引起某些基因的過度擴(kuò)增,導(dǎo)致正常細(xì)胞接受了異常的增殖、分化和生長(zhǎng)信號(hào),最終促使細(xì)胞發(fā)生癌變。盡管乳腺癌的發(fā)病率居高不下,死亡率卻不斷下降,其原因不僅得益于女性乳腺癌篩查和早診制度的建立,更得益于近年來不斷發(fā)展的分子生物學(xué)技術(shù)和綜合診療規(guī)范化水平的提高。乳腺癌的表觀遺傳學(xué)研究主要包括：組蛋白修飾、DNA甲基化及非編碼RNA。組蛋白(histone)是存在于真核生物細(xì)胞染色質(zhì)中的堿性蛋白質(zhì),含精氨酸和賴氨酸等堿性氨基酸較多。組蛋白有多種修飾形式,包括組蛋白末端的磷酸化、甲基化、泛素化、乙�；约疤腔揎椀�。DNA甲基化是指在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下,DNA的CG兩個(gè)核苷酸的胞嘧啶被選擇性地添加甲基,形成5-甲基胞嘧啶。非編碼RNA(microRNA或miRNA)是一段由18-24個(gè)核苷酸構(gòu)成的非編碼的單鏈小分子RNA,具有調(diào)節(jié)發(fā)育時(shí)相的作用,普遍存在于動(dòng)植物體內(nèi)并參與了生命過程中的一系列重要進(jìn)程,包括細(xì)胞的增殖、分化以及基因表達(dá)的調(diào)控等。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展涉及到多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,主要有Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、ER信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、受體酪氨酸激酶(RTK)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。Notch信號(hào)通路由受體、配體、CSL-DNA結(jié)合蛋白3個(gè)部分構(gòu)成。Notch是一個(gè)既簡(jiǎn)單又復(fù)雜的信號(hào)通路。Notch信號(hào)傳導(dǎo)的變化將導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生,其作用在不同組織細(xì)胞中有所不同,甚至在同一組織細(xì)胞的不同發(fā)展階段其作用也有所差異。ER是類固醇激素受體超家族成員之一,包括經(jīng)典的ER-α和新發(fā)現(xiàn)的ER-β。ER介導(dǎo)的信號(hào)通路可調(diào)控乳腺的生長(zhǎng)發(fā)育和細(xì)胞增殖。RTK存在于所有多細(xì)胞動(dòng)物中,參與多種細(xì)胞活動(dòng)的調(diào)控,尤其是參與細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化。RTK家族又分為多種亞類：EGFR家族、胰島素受體家族(IGF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)等,其中EGFR家族是與乳腺癌關(guān)系最為密切的生長(zhǎng)因子受體。Wnt信號(hào)通路不僅參與了早期胚胎中乳腺的發(fā)展,而且在其異常激活時(shí)導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖、腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與侵襲、抵抗凋亡,同時(shí)還與腫瘤細(xì)胞化療耐藥性有關(guān)。SET蛋白,1992年因首次在一名叫SE的白血病患者身上發(fā)現(xiàn)并鑒定而命名。SET有多個(gè)名稱,如模板活化因子-1β(TAF-1β)、蛋白磷酸酶2A抑制劑-2(I2PP2A)、組織相容性白細(xì)胞抗原Ⅱ相關(guān)蛋白(PHAP Ⅱ)、粒酶A激活的DNA酶活化抑制劑(IGAAD)等,通用名稱為SET。SET蛋白具有重要的功能,這源于其高度保守的結(jié)構(gòu)特征及進(jìn)化機(jī)制。SET廣泛表達(dá)于人類不同組織和細(xì)胞系,人的肺臟、腦、胚胎組織、子宮等均可克隆出SET的cDNA,且表達(dá)水平相似。SET可以特異高效性的抑制蛋白磷酸酶2A(PP2A)的活性,PP2A是一種重要的腫瘤抑制因子,參與細(xì)胞周期、DNA復(fù)制、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分化和細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化等多種細(xì)胞生物學(xué)事件,SET可以通過抑制PP2A,行使并完成多種生物學(xué)功能。SET可以通過抑制組蛋白乙酰化,促進(jìn)一些核受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄。這一抑制過程主要是由于SET與TAF-1α、pp32組成INHAT復(fù)合體,進(jìn)而通過INHAT結(jié)構(gòu)域與組蛋白結(jié)合并阻止組蛋白與組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)合,從而抑制組蛋白乙�；�。SET蛋白可促進(jìn)腺病毒DNA復(fù)制,在腺病毒基因組的復(fù)制過程中,宿主SET通過募集復(fù)制必需因子至裸露的DNA和核蛋白復(fù)合體上,從而促進(jìn)DNA復(fù)制。SET作為組蛋白分子伴侶,具有核小體裝配功能,這一功能在染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄過程中起到重要的促進(jìn)作用。SET參與細(xì)胞凋亡,這一過程可能是通過抑制DNA酶NM23-H1的活化和核小體的裝配功能而完成的。SET與多種臨床疾病相關(guān),在多種腫瘤組織中高表達(dá)。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是近幾年發(fā)展起來的新技術(shù),是一種特異、高效、經(jīng)濟(jì)的抑制基因表達(dá)的手段。RNA干擾技術(shù)涉及到dsRNA的酶切,Dicer酶是一種核酶復(fù)合體,屬于RNAase家族,dsRNA被這種酶切割成小分子RNA(siRNA), siRNA具有干擾同源性靶mRNA分子表達(dá)的功能,從而達(dá)到靶向基因沉默的目的。作為一種新的實(shí)驗(yàn)手段,RNAi技術(shù)廣泛應(yīng)用于基因治療,這項(xiàng)技術(shù)的飛速發(fā)展極大的促進(jìn)了人們對(duì)功能基因組學(xué)等方面的研究,這源于RNAi具有的幾個(gè)作用特點(diǎn)：序列特異性、高效穩(wěn)定性、雙干擾系統(tǒng)、可傳遞性和遺傳性。為了揭示SET蛋白在乳腺癌中的作用,本課題首先檢測(cè)了SET蛋白在乳腺癌患者組織中的表達(dá)情況,然后檢測(cè)SET被穩(wěn)定干擾后對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)與侵移的影響,并進(jìn)一步通過裸鼠成瘤探討SET干擾表達(dá)后在動(dòng)物水平上的生物學(xué)作用。本研究為更深入的揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供基礎(chǔ),同時(shí)為腫瘤的診斷和治療提供標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)。方法一、SET蛋白在臨床乳腺癌組織標(biāo)本中的表達(dá)1.免疫印跡(Western-blot)檢測(cè)組織中SET表達(dá)切取適量病人組織樣品,液氮研磨后加入蛋白裂解液,充分裂解后離心收取蛋白上清,按試劑盒說明書進(jìn)行蛋白定量,加入合適比例的上樣緩沖液,煮沸變性。蛋白溶液經(jīng)SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉,選取GAPDH作為內(nèi)參蛋白,加入一抗后4℃C孵育過夜。第二天用TBST洗膜,加二抗后孵育1小時(shí)后用TBST洗膜,冷CCD成像系統(tǒng)中曝光成像,用ImageJ軟件分析條帶的光密度,比較蛋白表達(dá)變化。2.免疫組化(IHC)檢測(cè)組織中SET表達(dá)切取適量病人組織樣品,4%多聚甲醛中固定組織,梯度乙醇脫水后石蠟包埋組織樣品。切取5微米組織切片,二甲苯脫蠟,梯度酒精再水化,過氧化氫中和組織中的過氧化氫酶,檸檬酸鹽緩沖液中加熱進(jìn)行抗原修復(fù),正常山羊血清封閉,加一抗后4℃過夜。第二天按二抗說明書加入加親合素結(jié)合的二抗孵育,DAB染色,蘇木精復(fù)染細(xì)胞核,中性樹膠封片,晾干后顯微鏡下鏡檢。二、SET穩(wěn)定缺陷乳腺癌細(xì)胞株的構(gòu)建1.靶向SET基因的shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定在GENBANK中查找SET的mRNA全序列設(shè)計(jì)SET特異性siRNA靶序列,BLAST同源分析證實(shí)其特異性,合成兩條shRNA的DNA模板單鏈,退火后連接到雙酶切后的pLVX-shRNAl載體上,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后進(jìn)行酶切和序列鑒定,鑒定無誤后大量擴(kuò)增并提取重組質(zhì)粒。2.慢病毒包裝重組質(zhì)粒選用293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝,按照慢病毒包裝試劑盒說明書配制各種成分,達(dá)到最高峰時(shí)收集病毒上清,滴度檢測(cè)。3.構(gòu)建SET缺陷型乳腺癌細(xì)胞株將病毒液按適當(dāng)比例與細(xì)胞培養(yǎng)基混合后轉(zhuǎn)導(dǎo)目的細(xì)胞,嘌呤霉素篩選,共篩選15天。提取細(xì)胞蛋白,按試劑盒說明進(jìn)行蛋白定量,Western-blot檢測(cè)SET蛋白。提取細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用RT-PCR測(cè)定SET mRNA的表達(dá)。三、RNA干擾抑制SET表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響1.MTT法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)速度接種每組細(xì)胞于96孔板,MTT法繪制細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)曲線,確立線性關(guān)系。連續(xù)7天檢測(cè)并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間。2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡接種每組細(xì)胞于6孔板,培養(yǎng)貼壁后收集細(xì)胞,按照Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒處理細(xì)胞,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。3.細(xì)胞劃痕檢測(cè)腫瘤細(xì)胞遷移接種每組細(xì)胞于6孔板,培養(yǎng)貼壁后在6孔板內(nèi)垂直劃線,分別于0h、12h、24h取樣觀察并拍照細(xì)胞向劃痕區(qū)域的遷移情況。4.細(xì)胞侵襲檢測(cè)培養(yǎng)各組乳腺癌細(xì)胞株,采用Transwell小室接種細(xì)胞,通過計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞侵襲力的變化。四、RNAi沉默SET基因?qū)θ巳橄侔┘?xì)胞株裸鼠皮下移植瘤的影響1.裸鼠成瘤動(dòng)物模型的制備將裸鼠隨機(jī)分組,無菌注射各組乳腺癌細(xì)胞株,致瘤成功后每5天測(cè)量腫瘤體積,30天后脫頸法處死裸鼠,解剖取出腫瘤組織并稱取腫瘤質(zhì)量。2. Western-blot檢測(cè)瘤體組織中SET表達(dá)切取適量裸鼠成瘤的瘤體組織樣品,液氮研磨后加入蛋白裂解液,充分裂解后離心收取蛋白上清,按試劑盒說明書進(jìn)行蛋白定量,加入合適比例的上樣緩沖液,煮沸變性。蛋白溶液經(jīng)SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉,選取GAPDH作為內(nèi)參蛋白,加入一抗后4℃孵育過夜。第二天用TBST洗膜,加二抗后孵育1小時(shí)后用TBST洗膜,冷CCD成像系統(tǒng)中曝光成像,用ImageJ軟件分析條帶的光密度,比較蛋白表達(dá)變化。3.IHC檢測(cè)瘤體組織中SET表達(dá)切取適量裸鼠成瘤的瘤體組織樣品,4%多聚甲醛中固定組織,梯度乙醇脫水后石蠟包埋組織樣品。切取5微米組織切片,二甲苯脫蠟,梯度酒精再水化,過氧化氫中和組織中的過氧化氫酶,檸檬酸鹽緩沖液中加熱進(jìn)行抗原修復(fù),正常山羊血清封閉,加一抗后4℃過夜。第二天按二抗說明書加入加親合素結(jié)合的二抗孵育,DAB染色,蘇木精復(fù)染細(xì)胞核,中性樹膠封片,晾干后顯微鏡下鏡檢。五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)結(jié)果以±S表示,根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)各組之間進(jìn)行單因素方差分析、析因設(shè)計(jì)的方差分析并進(jìn)行了方差齊性檢驗(yàn),采用了重復(fù)測(cè)量的方差分析,并進(jìn)行了球形檢驗(yàn),以p0.05為方差齊性及滿足球形檢驗(yàn),之后采用基于方差分析的多重比較方法,p0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)吸光度和細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行直線擬合,并進(jìn)行線性回歸分析。結(jié)果一、SET蛋白在臨床乳腺癌組織標(biāo)本中的表達(dá)經(jīng)液氮研磨法提取乳腺癌病例組織蛋白,進(jìn)行Western-blot檢測(cè)SET在組織中的表達(dá)情況,可以看出SET蛋白在癌旁組織與癌組織中的表達(dá)均高于其正常乳腺組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義p0.001)。免疫組化結(jié)果顯示SET在乳腺細(xì)胞胞核胞漿內(nèi)均有表達(dá),在癌組織、癌旁組織中呈現(xiàn)大量棕黃色顆粒,而在正常乳腺組織中,只有少量淺黃色顆粒。二、SET穩(wěn)定缺陷乳腺癌細(xì)胞株的構(gòu)建1.成功構(gòu)建靶向SET基因的shRNA表達(dá)載體設(shè)計(jì)出針對(duì)SET的siRNA,將退火后的雙鏈寡核苷酸片段克隆到pLVX-shRNAl載體,經(jīng)過陽性菌落酶切鑒定與測(cè)序,結(jié)果正確。2.慢病毒上清滴度檢測(cè)293T細(xì)胞包裝慢病毒,達(dá)到最高峰時(shí)收集病毒上清,滴度檢測(cè)顯示病毒液滴度在5×106-5×107之間,滴度較高。3.成功構(gòu)建SET缺陷型乳腺癌細(xì)胞株與未轉(zhuǎn)染的對(duì)照組乳腺癌細(xì)胞株相比,攜帶SET基因干擾片段shRNA病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)兩種乳腺癌細(xì)胞株后,SET蛋白的表達(dá)明顯受到抑制,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.001)。Western-blot與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果一致。三、RNA干擾抑制SET表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響1.細(xì)胞生長(zhǎng)速度MTT法繪制細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性關(guān)系良好。連續(xù)7天繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,psiRNA-SET缺陷組細(xì)胞生長(zhǎng)均變得緩慢,生長(zhǎng)曲線較平緩。根據(jù)公式計(jì)算出細(xì)胞倍增時(shí)間,發(fā)現(xiàn)SET缺陷組細(xì)胞的倍增時(shí)間延長(zhǎng)。2.細(xì)胞凋亡與對(duì)照組細(xì)胞的凋亡情況相比,psiRNA-SET缺陷組細(xì)胞的凋亡率明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義p0.001)。3.細(xì)胞劃痕檢測(cè)腫瘤細(xì)胞遷移測(cè)量劃痕寬度并經(jīng)公式計(jì)算后得出細(xì)胞的遷移率,結(jié)果顯示在兩種乳腺癌細(xì)胞中,psiRNA-SET缺陷組細(xì)胞的遷移率均低于其對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.001)。4.細(xì)胞侵襲檢測(cè)每種乳腺癌細(xì)胞株的對(duì)照組和pLVX空白質(zhì)粒對(duì)照組的穿膜細(xì)胞數(shù)無明顯區(qū)別,而psiRNA-SET組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯低于其他兩組培養(yǎng)各組乳腺癌細(xì)胞株,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.001)。四、RNAi沉默SET基因?qū)θ巳橄侔┘?xì)胞株裸鼠皮下移植瘤的影響1.成瘤及生長(zhǎng)接種乳腺癌腫瘤細(xì)胞后,所有裸鼠在實(shí)驗(yàn)過程中存活狀態(tài)良好,均無意外死亡。繪制各組裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)曲線顯示,psiRNA-SET細(xì)胞組種植瘤生長(zhǎng)速度顯著低于其對(duì)照組及pLVX空白質(zhì)粒組細(xì)胞。30天后處死裸鼠,剝離種植瘤稱重,發(fā)現(xiàn)psiRNA-SET細(xì)胞組的種植瘤重量均明顯低于其對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義p0.001)。2.SET在瘤體組織中的表達(dá)經(jīng)液氮研磨法提取各組種植瘤瘤體組織蛋白,進(jìn)行Western-blot檢測(cè)SET在組織中的表達(dá)情況,可以看出psiRNA-SET細(xì)胞組的種植瘤中SET蛋白的表達(dá)低于對(duì)照組,免疫組化結(jié)果與此一致。結(jié)論1.本研究結(jié)果表明,SET蛋白在乳腺癌癌旁組織及癌變組織中的表達(dá)明顯高于在正常乳腺組織中的表達(dá)。2.本研究成功構(gòu)建了穩(wěn)定干擾SET乳腺癌細(xì)胞株,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了模式細(xì)胞株。3.本研究結(jié)果表明,SET缺陷表達(dá)后可在一定程度上抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖,促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡,并可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。4.本研究結(jié)果顯示,穩(wěn)定干擾SET的表達(dá)后,在一定程度上抑制了腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力,并且在裸鼠體內(nèi)能夠維持SET的低表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：乳腺癌 SET RNAi 轉(zhuǎn)移 侵襲 裸鼠成瘤
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.9
【目錄】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-24
• 前言24-29
• 材料與方法29-58
• 1 材料29-36
• 1.1 臨床樣品來源29
• 1.2 細(xì)胞、菌株及質(zhì)粒29-30
• 1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物30
• 1.4 主要試劑30-32
• 1.5 主要儀器32-34
• 1.6 主要試劑配制34-36
• 2 方法36-58
• 2.1 SET蛋白在臨床乳腺癌組織樣品中的表達(dá)36-41
• 2.2 SET穩(wěn)定缺陷乳腺癌細(xì)胞株的構(gòu)建41-52
• 2.3 RNA干擾抑制SET表達(dá)對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響52-55
• 2.4 RNAi沉默SET基因?qū)θ巳橄侔┘?xì)胞株裸鼠皮下移植瘤的影響55-57
• 2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析57-58
• 結(jié)果58-84
• 1 SET蛋白在乳腺癌組織中表達(dá)的情況58-60
• 1.1 Western-blot檢測(cè)SET蛋白在乳腺癌組織中表達(dá)的情況58-59
• 1.2 免疫組化檢測(cè)SET蛋白在乳腺癌組織中表達(dá)的情況59-60
• 2 SET穩(wěn)定缺陷乳腺癌細(xì)胞株的構(gòu)建60-68
• 2.1 psiRNA重組質(zhì)粒的測(cè)序鑒定60-61
• 2.2 病毒滴度檢測(cè)61-62
• 2.3 puromycin最佳濃度的確定及細(xì)胞篩選62
• 2.4 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)SET基因表達(dá)62-67
• 2.5 Western-blot分析SET蛋白表達(dá)67-68
• 3 RNA干擾抑制SET表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響68-77
• 3.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)68-72
• 3.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡72-73
• 3.3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞遷移73-75
• 3.4 Transwell侵襲小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力75-77
• 4 RNAi沉默SET基因?qū)θ巳橄侔┘?xì)胞株裸鼠皮下移植瘤的影響77-84
• 4.1 psiRNA-SET對(duì)裸鼠成瘤的影響77-81
• 4.2 免疫印跡結(jié)果81-82
• 4.3 免疫組化結(jié)果82-84
• 討論84-93
• 全文結(jié)論93-94
• 綜述94-107
• 參考文獻(xiàn)107-120
• 攻讀學(xué)位期間成果120-121
• 致謝121-124
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)證明124

，

本文編號(hào)：804124