本文關鍵詞：脈沖電磁場對低彈多孔鈦合金的生物協(xié)同效應研究

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【摘要】：背景多孔鈦合金與實體鈦合金相比能夠改善植入物的骨整合,是近年金屬植入物研究熱點。但是多孔鈦合金(Ti-6Al-4V)孔隙結構內部骨長入不是十分理想,特別是體積較大多孔材料中心骨長入較少。經過前期的研究,我們分析骨長入不佳的可能原因為:1、多孔結構的采用僅能降低鈦合金部件表觀彈性模量,而材料本身力學性能沒有實質變化,與骨組織微觀力學性能不匹配依然存在;2、正常骨組織具有壓電效應,其力-電轉換特性可將外界應力刺激轉換為內部電磁信號,電信號對于骨修復與改建至關重要,而植入部位由于正常骨組織的缺失,無法產生骨修復所需的相應電磁信號。為解決上述問題,本研究采用電子束熔融(Electron beam melting,EBM)技術,以新型低彈性模量Ti-24Nb-4Zr-7.9Sn(Ti2448)合金粉末制備新型低彈性模量多孔鈦合金;同時,引入外源性脈沖電磁場(Pulsed Electromagnetic Fields,PEMF)進行干預,模擬正常骨組織產生的內源性電磁信號。課題組前期研究已證實了PEMF可加強成骨細胞與鈦合金(Ti-6Al-4V)表面的生物兼容性。然而,PEMF和新型低彈性模量多孔鈦合金協(xié)同的生物學效應尚未見報道。因此,本研究通過體外細胞實驗和動物體內埋植實驗,驗證PEMF與低彈性模量多孔鈦合金的協(xié)同生物學作用。目的1、評價PEMF對多孔Ti2448材料表面成骨細胞活性的影響;2、評價PEMF對動物體內多孔Ti2448植入物的骨長入和骨整合的作用效果。方法1、多孔Ti2448材料的制備:沿用課題組前期研究的多孔參數(shù),在Materialise軟件中設計多孔鈦合金三維模型,將模型數(shù)據(jù)導入EBM設備,以新型低彈鈦合金Ti2448粉末為原料制備兩種外部規(guī)格的多孔Ti2448材料,采用掃描電子顯微鏡檢測材料表面形態(tài)和元素組成;2、PEMF平臺的搭建:PEMF平臺由PEMF發(fā)生器和線圈組成。PEMF發(fā)生器使用GHY-Ⅲ型;線圈則分為兩種,細胞實驗用線圈為Helm Holz雙線圈,動物實驗用線圈為改進型Helm Holz三線圈以獲得更大范圍的均勻電磁場。將線圈與電磁場發(fā)生器連接并通電,待電流穩(wěn)定后使用高斯計檢測線圈內部和中心區(qū)域的磁感強度,以及周圍環(huán)境的磁感強度。3、體外細胞實驗:小鼠成骨前體細胞MC3T3-E1接種于多孔Ti2448片表面,每日進行PEMF暴露2h,與未暴露PEMF的多孔Ti2448片表面細胞進行比較,在暴露后1天、4天、7天等不同時間點通過細胞增殖、掃描電子顯微鏡、活死細胞熒光染色、實時定量PCR等細胞學檢測手段進行分析。4、動物體內試驗:24只雌性成年新西蘭兔隨機分為2組,雙側股骨外側髁部植入多孔Ti2448棒,一組進行PEMF暴露2h/日,一組無PEMF暴露,術后4周、12周取材行熒光觀察、Van Gieson染色檢測等。結果制備的多孔Ti2448材料為規(guī)則疏松多孔結構,孔徑710±42μm,孔隙率68±5.3%,多孔鈦片直徑12 mm×高度3 mm,多孔鈦棒直徑6 mm×高度10 mm,表面形態(tài)粗糙。成功搭建用于細胞實驗和動物實驗的脈沖電磁場發(fā)生平臺,經檢測,線圈內部磁感強度為2 m T,周圍環(huán)境磁感強度為0.05±0.002 m T。細胞增殖實驗中脈沖電磁場刺激后第1天沒有明顯差別,第4天、第7天實驗組(PEMF)細胞數(shù)均高于對照組(p0.01);活死細胞熒光染色發(fā)現(xiàn)兩組多孔Ti2448片表面大多數(shù)為活細胞綠色熒光,死細胞紅色熒光相對較少,而實驗組與對照組相比可見更多的綠色熒光細胞與細胞群的形成,高倍鏡下細胞偽足清晰,細胞狀態(tài)良好;掃描電鏡下也可見明顯細胞偽足,細胞狀態(tài)良好,低倍鏡下實驗組細胞數(shù)量也明顯多于對照組;成骨相關基因PCR結果顯示,第4天對照組與實驗組的堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein,BMP-2)基因表達沒有差異,而實驗組的1型膠原(type 1 collagen,Col-1)、骨鈣素(osteocalcin,OCN)、骨橋蛋白(osteopontin,OPN)和runt相關轉錄因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)基因表達量均高于對照組(p0.05),第7天實驗組ALP、Col-1、OCN、Runx2和BMP-2基因表達量均高于對照組(p0.05),而OPN的表達量沒有差異,但已處于較高表達水平。動物實驗中新骨(鈣鹽沉積)熒光標記成線性排列,術后4周和12周,實驗組新生骨沉積速率(兩種熒光間距)均高于對照組(p0.05),Van Gieson染色發(fā)現(xiàn),術后4周兩組的多孔Ti2448植入材料周圍均有散在新生骨組織環(huán)繞,新骨與材料之間可見明顯縫隙,對照組新骨長入較少且中心部位空洞,實驗組有較多新骨長入,中心部位也可見少量不規(guī)則新骨長入;術后12周,兩組多孔材料內部均有較多的骨長入,實驗組與對照組相比,骨長入量則更多,對照組材料與新骨之間還存在少量的間隙,而實驗組新骨和材料結合緊密,骨整合良好。新骨量百分比半定量分析顯示,術后4周和12周,實驗組新生骨面積百分比均高于對照組(p0.05)。結論EBM技術制備的多孔Ti2448植入物表觀彈性模量和微觀力學性能都能夠更好的與骨組織匹配。PEMF在體外能夠促進多孔Ti2448材料表面成骨前體細胞的活性,在體內能夠加強多孔Ti2448植入物骨長入和骨整合,表明PEMF與多孔Ti2448協(xié)同作用效果良好,二者的聯(lián)合應用具有廣闊的臨床前景。
【關鍵詞】：多孔鈦合金 脈沖電磁場 骨整合 成骨
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R687.32
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-16
• 文獻回顧16-27
• 第一部分 多孔鈦合金的設計和制備27-35
• 1 引言27-28
• 2 材料與方法28-29
• 2.1 多孔鈦合金的設計28-29
• 2.2 EBM技術制備過程29
• 2.3 多孔Ti2448材料的表面檢測29
• 3 結果29-31
• 3.1 多孔鈦合金材料外部形態(tài)29-30
• 3.2 多孔鈦合金表面形態(tài)30
• 3.3 化學元素分析30-31
• 4 討論31-35
• 第二部分 脈沖電磁場對多孔TI2448表面MC3T3-E1細胞生物學行為影響研究35-52
• 1 引言35-36
• 2 材料與方法36-41
• 2.1 多孔鈦合金片的制備36
• 2.2 細胞培養(yǎng)36
• 2.3 脈沖電磁場發(fā)生裝置的搭建36-37
• 2.4 實驗分組37
• 2.5 細胞粘附和增殖37
• 2.6 細胞活力檢測37-38
• 2.7 細胞形態(tài)38
• 2.8 成骨相關基因表達38-40
• 2.9 統(tǒng)計學方法40-41
• 3 結果41-45
• 3.1 細胞粘附與增殖41
• 3.2 細胞活力檢測41-42
• 3.3 細胞形態(tài)42-43
• 3.4 成骨相關基因表達43-45
• 4 討論45-52
• 第三部分 脈沖電磁場對動物體內多孔TI2448骨長入的影響研究52-65
• 1 引言52-53
• 2 材料和方法53-56
• 2.1 多孔Ti2448棒的制備53
• 2.2 脈沖電磁場發(fā)生裝置的構建53-54
• 2.3 實驗動物和分組54
• 2.4 骨缺損模型的建立54-55
• 2.5 熒光標記55
• 2.6 標本取材和處理55
• 2.7 統(tǒng)計學分析55-56
• 3 結果56-59
• 3.1 熒光標記結果56-57
• 3.2 組織學染色57-59
• 4 討論59-65
• 小結65-66
• 參考文獻66-83
• 個人簡歷和研究成果83-84
• 致謝84

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本文編號：799892