本文關(guān)鍵詞：miR-483-3p對人神經(jīng)母細胞瘤增殖、凋亡、侵襲及遷移的影響及作用機制研究

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【摘要】：研究背景神經(jīng)母細胞瘤(Neuroblastoma,NB)是嬰幼兒最常見的惡性實性腫瘤,其發(fā)病率約占兒童腫瘤的7%-10%。神經(jīng)母細胞瘤一般起源于交感神經(jīng)節(jié)或腎上腺髓質(zhì)的原始神經(jīng)嵴細胞,男性發(fā)病率略高。與其它腫瘤相比,神經(jīng)母細胞瘤惡性程度高,常在短期內(nèi)突破包膜而浸潤周圍組織及器官而發(fā)生轉(zhuǎn)移。原則上有交感神經(jīng)節(jié)的部位均可發(fā)生腫瘤,頸部、胸部、腹部及腹膜后均是神經(jīng)母細胞瘤的好發(fā)部位。多種分子生物學(xué)的異常被認為與神經(jīng)母細胞瘤有著密切的關(guān)系,如MYCN異常表達、抑癌基因序列1p36.1及1p36.2缺失等分子生物學(xué)的異常均已逐步成為兒童神經(jīng)母細胞瘤分級的重要指標。盡管神經(jīng)母細胞瘤的分子生物學(xué)研究已取得重大進展,然而兒童神經(jīng)母細胞瘤的預(yù)后并未有明顯的改善,探索新的分子靶向治療途徑是我們研究的重要方向。微小RNA(microRNA, miRNA)是一類廣泛存在真核生物體內(nèi)的長度為21～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA。miRNA通過與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA induced silence complex, RISC)結(jié)合形成非對稱性的RISC,而結(jié)合RISC后可與靶基因結(jié)合而達到降解mRNA或抑制mRNA轉(zhuǎn)錄后的翻譯,最終通過調(diào)節(jié)蛋白表達而在體內(nèi)多個重要環(huán)節(jié)中發(fā)揮作用。大量研究表明miRNA在腫瘤中存在明顯異常表達,而niRNA的異常表達對腫瘤的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移均發(fā)揮著重要的作用。前期Guo等通過miRNA基因芯片檢測高危組神經(jīng)母細胞瘤與低危組神經(jīng)母細胞瘤的miRNA表達譜發(fā)現(xiàn),高危組與低危組神經(jīng)母細胞瘤的miRNA表達譜存在差異,如在高危組中,miR-17-92, miR-181, miR-21, miR-380-5p, miR-483-3p等明顯上調(diào),而miR-34a, miR-542-5p, let-7, miR-204等明顯下調(diào)。功能實驗中亦證實多種miRNA在神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖、凋亡、分化、侵襲及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用。miR-483最早于人體新生兒的肝臟組織中發(fā)現(xiàn),其定位于染色體11p15的IGF-2基因內(nèi)含子內(nèi)。其主要包括miR-483-3p及miR-483-5p兩種,兩者均在腫瘤中發(fā)揮著重要的作用。如miR-483-3p在肝癌中發(fā)揮著癌基因的作用,通過抑制其表達后可以明顯的促進腫瘤細胞的凋亡,而miR-483-5p亦被證明在腎上腺皮質(zhì)腫瘤中發(fā)揮著癌基因的作用。過往研究采用miRNA基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)高危組的神經(jīng)母細胞瘤的miR-483-3p表達量明顯高于低危組,然而其對神經(jīng)母細胞瘤的作用及機制目前尚未見報道。本研究首先通過qRT-PCR驗證miR-483-3p在神經(jīng)母細胞瘤組織標本及細胞中的表達情況,并進一步在細胞及動物實驗中驗證miR-483-3p對神經(jīng)母細胞瘤的增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移的影響,并通過計算機軟件預(yù)測及分子生物學(xué)實驗探索了miR-483-3p對神經(jīng)母細胞瘤發(fā)揮作用的可能機制。研究內(nèi)容與結(jié)果第一部分：miR-483-3p在人神經(jīng)母細胞瘤組織標本及細胞中的表達及意義1.1目的通過qRT-PCR技術(shù)驗證高危組神經(jīng)母細胞瘤(轉(zhuǎn)移瘤)及中低危組神經(jīng)母細胞瘤(原發(fā)瘤)組織標本及細胞株中的miR-483-3p的表達差異。1.2方法①收集組織標本,并詳細記錄組織標本對應(yīng)的腫瘤病理類型、分級、分期、年齡、NMYC基因擴增倍數(shù)等相關(guān)資料,標本于液氮速凍后于-70℃冰箱內(nèi)保存。購買神經(jīng)母細胞瘤細胞株,快速復(fù)蘇細胞后采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)；②取等量組織標本在冰上研磨(等量細胞),利用RNA提取試劑盒(操作嚴格按說明書進行)提取總RNA；③使用一步法配置RNA反轉(zhuǎn)錄液后,將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;④按說明書配置RT-PCR反應(yīng)液,利用PCR儀對miR-483-3p進行擴增；⑤采用Quantitation-Comparative Ct軟件對結(jié)果進行分析。1.3結(jié)果高危組神經(jīng)母細胞瘤組織標本中的miR-483-3p的表達量明顯高于低危組神經(jīng)母細胞瘤組織標本(t=6.171, P=0.000), miR-483-3p的表達量隨著腫瘤的分期升高而升高(F=12.267,P=0.000)。神經(jīng)母細胞瘤細胞的miR-483-3p表達量明顯高于正常細胞(F=30.998,P=0.000),惡性度高的神經(jīng)母細胞瘤細胞株(SH-SY5Y、SK-N-BE)的miR-483-3p表達量亦明顯高于惡性度較低的細胞株(IMR-32)(均P0.05)。1.4結(jié)論無論是組織標本還是細胞水平,惡性程度高的神經(jīng)母細胞瘤的miR-483-3p表達水平明顯高于惡性程度低的神經(jīng)母細胞瘤,miR-483-3p可能是神經(jīng)母細胞瘤診斷分期及預(yù)后判斷的重要指標。第二部分：miR-483-3p對人神經(jīng)母細胞瘤細胞體外增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移的影響2.1目的明確miR-483-3p對人神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖、凋亡、侵襲及遷移等功能的影響。2.2方法①人工合成miR-483-3p mimicss miR-483-3p inhibitors及陰性對照的siRNA,并采用綠色熒光蛋白進行標記；②使用LipolifectmainTM2000將miR-483-3p mimics、miR-483-3p inhibitors及陰性對照轉(zhuǎn)染至神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y及SK-N-BE細胞株內(nèi),并使用熒光顯微鏡確認其的轉(zhuǎn)染效率；③采用CCK-8法檢測miR-483-3p對人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y及SK-N-BE細胞株增殖活性的影響；④采用細胞克隆形成實驗觀察miR-483-3p對神經(jīng)母細胞瘤細胞克隆形成能力的影響；⑤流式細胞術(shù)檢測miR-483-3p對神經(jīng)母細胞瘤細胞周期的影響；⑥Transwell法檢測miR-483-3p對神經(jīng)母細胞瘤細胞遷移及侵襲(加基質(zhì)膠)的影響。2.3結(jié)果LipolifectmainTM2000可以成功的將miR-483-3p mimics及miR-483-3p inhibitors轉(zhuǎn)入神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y及SK-N-BE細胞株中,熒光顯微鏡均可見綠色熒光蛋白表達。qRT-PCR結(jié)果進一步證實轉(zhuǎn)染miR-483-3p mimics后神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y及SK-N-BE細胞株中的miR-483-3p表達量上調(diào)10-13倍(P均0.01),而轉(zhuǎn)染miR-483-3p inhibitors后神經(jīng)母細胞瘤細胞株的miR-483-3p表達量下調(diào)2-3倍(P均0.05)。采用CCK-8法繪制的生長曲線表明上調(diào)miR-483-3p的表達可以明顯的增強神經(jīng)母細胞瘤細胞的增殖能力,在miR-483-3p mimics轉(zhuǎn)染48h、72h及96h后神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y及SK-N-BE細胞的OD值明顯升高(P均0.05),而下調(diào)miR-483-3p可明顯抑制神經(jīng)母細胞瘤細胞的增殖能力,其作用48h、72h及96h后OD值明顯下降(P均0.05)。細胞克隆形成實驗證明miR-483-3p mimics作用后神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y及SK-N-BE細胞株的克隆形成數(shù)多于陰性對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而下調(diào)miR-483-3p的表達后神經(jīng)母細胞瘤細胞的克隆形成數(shù)減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明上調(diào)miR-483-3p的表達可以使得神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞處于S期及G2期的細胞明顯增加,而處于G0/G1期的細胞明顯減少,與對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),這也提示miR-483-3p mimics可以促進神經(jīng)母細胞瘤細胞的增殖,使更多細胞進行有絲分裂；而下調(diào)miR-483-3p的表達后,處于G0/G1期的細胞增多,而S期及G2期細胞減少(P0.05),細胞增殖能力下降,凋亡細胞增加。Transwell法實驗結(jié)果表明niR-483-3p可以影響神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y及SK-N-BE細胞的遷移及侵襲能力,上調(diào)miR-483-3p表達后神經(jīng)母細胞瘤的細胞遷徙及侵襲能力增強,遷移至下孔的細胞數(shù)多于陰性對照組(P均0.05)。而轉(zhuǎn)染miR-483-3p inhibitor后下孔的細胞數(shù)較陰性對照組減少(P均0.05),即細胞的遷移及侵襲能力下降。2.4結(jié)論上調(diào)miR-483-3p可以促進神經(jīng)母細胞瘤細胞的增殖及克隆形成能力,使得神經(jīng)母細胞瘤細胞的侵襲及遷移能力明顯提高,而抑制miR-483-3p的表達則可以抑制神經(jīng)母細胞瘤的增殖、侵襲及遷移能力,并促進神經(jīng)母細胞瘤細胞的凋亡。miR-483-3p在神經(jīng)母細胞瘤中發(fā)揮‘癌基因’的作用。第三部分：miR-483-3p靶基因的鑒定及其調(diào)控人神經(jīng)細胞瘤細胞的機制3.1目的探索miR-483-3p對人神經(jīng)母細胞瘤細胞作用的可能機制,并通過調(diào)節(jié)靶基因的表達驗證niR-483-3p與靶基因之間的關(guān)系。3.2方法①通過miRNA靶標預(yù)測軟件(miRbase, miRwalk, Targetscan等)結(jié)合現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫資料,篩選miR-483-3p發(fā)揮作用的靶基因；②采用Western blot檢測miR-483-3p對神經(jīng)母細胞瘤細胞相應(yīng)靶基因蛋白表達的影響。(主要步驟：a利用細胞裂解液裂解miR-483-3p mimics、miR-483-3p inhibitors及陰性對照siRNA作用后神經(jīng)母細胞瘤細胞,提抽蛋白；b采用BCA法進行蛋白定量；c依據(jù)蛋白分子量配置相應(yīng)濃度積層膠及分離膠,加入電泳緩沖液,待其凝固后取等量蛋白加入泳道中進行電泳分離蛋白；d利用電轉(zhuǎn)儀進行轉(zhuǎn)膜,將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；e封閉液封閉后依次加入一抗、二抗進行免疫反應(yīng)；f加入ECL顯影液,進行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；g凝膠圖像分析);③構(gòu)建熒光素酶報告基因載體,將其與miR-483-3p mimics及陰性對照siRNA共轉(zhuǎn)染神經(jīng)母細胞瘤細胞,進行熒光素酶報告檢測,驗證miR-483-3p與靶基因的3’-UTR之間的關(guān)系；④合成針對靶基因的siRNA,觀察其對靶基因蛋白表達的影響,使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后觀察其對神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖、凋亡、侵襲及遷移的影響。⑤合成上調(diào)靶基因表達的質(zhì)粒,觀察其對miR-483-3p作用后的神經(jīng)母細胞瘤細胞功能的影響。3.3結(jié)果我們通過靶基因預(yù)測軟件篩選出了IGF-1及PUMA基因作為miR-483-3p的潛在靶標。Western blot結(jié)果表明高表達miR-483-3p后神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞的PUMA蛋白含量降低(P0.05),而下調(diào)miR-483-3p的表達后神經(jīng)母細胞瘤的PUMA蛋白表達量較陰性對照組升高(P0.05)。然而無論是上調(diào)還是下調(diào)miR-483-3p的表達,神經(jīng)母細胞瘤細胞中的IGF-1的蛋白表達變化并不明顯,與陰性對照組比較差異并不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均0.05)。雙熒光素酶實驗證實miR-483-3p可以與PUMA的3’-UTR結(jié)合,與miR-483-3p共同轉(zhuǎn)染細胞后,PUMA3'-UTR表達量下調(diào),而其不能與突變型PUMA3'-UTR結(jié)合,其作用后突變型PUMA 3'-UTR并無明顯下降,兩者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.05)。為了進一步驗證miR-483-3p發(fā)揮作用與PUMA基因有關(guān),我們通過人工合成了針對PUMA基因的siRNA及高表達PUMA基因(不含3'-UTR)的質(zhì)粒。通過功能實驗發(fā)現(xiàn),下調(diào)PUMA蛋白表達后神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞增殖、細胞克隆形成能力明顯增強(P均0.05),發(fā)揮著與miR-483-3p類似的作用,而下調(diào)PUMA基因后神經(jīng)母細胞瘤的侵襲及遷移的能力并無明顯改變(P均0.05)。而轉(zhuǎn)染高表達PUMA質(zhì)粒后可使miR-483-3p作用后神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞的PUMA蛋白表達量升高,而進一步的功能實驗也證實上調(diào)PUMA基因的表達可部分逆轉(zhuǎn)miR-483-3p對神經(jīng)母細胞瘤細胞的增殖及克隆形成的影響。3.4結(jié)論①miR-483-3p對神經(jīng)母細胞瘤細胞發(fā)揮作用可能與抑制細胞的PUMA基因表達密切相關(guān)；②PUMA基因是一種重要的促凋亡因子,下調(diào)其表達可以明顯促進神經(jīng)母細胞瘤細胞的增殖及克隆形成能力,而上調(diào)其表達可部分逆轉(zhuǎn)miR-483-3p對神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖及克隆形成能力；③miR-483-3p對神經(jīng)母細胞瘤的作用不僅與PUMA基因有關(guān),還可能通過調(diào)節(jié)其它基因的表達而發(fā)揮作用,具體機制仍有待進一步實驗證實。第四部分：miR-483-3p過表達對人神經(jīng)母細胞瘤細胞裸鼠體內(nèi)成瘤的影響4.1目的通過體內(nèi)實驗進一步驗證niR-483-3p對裸鼠神經(jīng)母細胞瘤移植瘤生長的影響。4.2方法①合成miR-483-3p高表達質(zhì)粒(經(jīng)過靶基因合成、PCR擴增、酶切、連接、轉(zhuǎn)化及質(zhì)粒提抽等步驟,合成的質(zhì)粒采用PCR及基因測序進行驗證),合成的質(zhì)粒使用脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染至神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞內(nèi)。②轉(zhuǎn)染后使用qRT-PCR驗證轉(zhuǎn)染后神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞中niR-483-3p的表達。③將轉(zhuǎn)染miR-483-3p的SH-SY5Y細胞及轉(zhuǎn)染陰性對照的SH-SY5Y細胞同時種植4-6周齡BALB/C裸鼠臀區(qū)皮下,建立裸鼠神經(jīng)母細胞瘤模型,觀察腫瘤體積及變化和各組腫瘤重量,計算抑瘤率,繪制腫瘤生長曲線。④取液氮中保存的動物腫瘤組織標本,封閉后依次加入一抗、二抗、DAB顯色,使用顯微鏡計數(shù)兩組腫瘤血管密度。⑤采用western blot檢測兩組移植瘤組織標本中PUMA蛋白的表達。4.3結(jié)果轉(zhuǎn)染]miR-483-3p后神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞株中的miR-483-3p表達量明顯升高,與陰性對照組相比,差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01)。4周后穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-483-3p的神經(jīng)母細胞瘤細胞形成的腫瘤體積明顯大于陰性對照組(P0.01),而腫瘤的重量也明顯重于陰性對照組(P0.01)。miR-483-3p轉(zhuǎn)染組的腫瘤微血管密度明顯高于陰性對照組,兩兩比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-483-3p組的動物移植瘤標本中PUMA蛋白較陰性對照組明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而這與體外實驗結(jié)果是一致的。4.4結(jié)論通過皮下注射的方法可以成功構(gòu)建裸鼠神經(jīng)母細胞瘤的移植瘤模型。上調(diào)miR-483-3p的表達可以明顯的促進體內(nèi)神經(jīng)母細胞瘤腫瘤的生長及血管形成。本實驗通過體內(nèi)實驗進一步的證實miR-483-3p發(fā)揮作用與調(diào)節(jié)PUMA蛋白表達有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：神經(jīng)母細胞瘤 miRNA 腫瘤轉(zhuǎn)移 PUMA miR-483-3p IGF
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R739.41
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-21
• 前言21-26
• 第一部分 MIR-483-3P在人神經(jīng)母細胞瘤組織標本及細胞中的表達及意義26-41
• 1.1 實驗材料27-29
• 1.2 實驗方法29-32
• 1.3 實驗結(jié)果32-35
• 1.4 討論35-39
• 1.5 小結(jié)39
• 1.6 參考文獻39-41
• 第二部分 MIR-483-3P對人神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移及侵襲的影響41-60
• 2.1 實驗材料42-44
• 2.2 實驗方法44-47
• 2.3 實驗結(jié)果47-54
• 2.4 討論54-57
• 2.5 小結(jié)57
• 2.6 參考文獻57-60
• 第三部分 MIR-483-3P靶基因的鑒定及其調(diào)控人神經(jīng)細胞瘤細胞的機制60-81
• 3.1 實驗材料60-62
• 3.2 實驗方法62-69
• 3.3 實驗結(jié)果69-76
• 3.4 討論76-78
• 3.5 小結(jié)78-79
• 3.6 參考文獻79-81
• 第四部分 MIR-483-3P對人神經(jīng)母細胞瘤的作用及機制研究的體內(nèi)實驗81-94
• 4.1 實驗材料81-82
• 4.2 實驗方法82-86
• 4.3 實驗結(jié)果86-90
• 4.4 討論90-92
• 4.5 小結(jié)92-93
• 4.6 參考文獻93-94
• 全文總結(jié)94-95
• 綜述95-108
• 參考文獻102-108
• 兒童單孔腹腔鏡闌尾切除術(shù)的安全性及可行性:單中心、隨機對照研究108-123
• 摘要108-110
• ABSTRACT110-112
• 前言112-113
• 1.實驗方法113-116
• 2.實驗結(jié)果116-118
• 3.討論118-121
• 4.結(jié)論121
• 5.參考文獻121-123
• 中英文對照縮略詞表123-125
• 攻讀學(xué)位期間成果125-126
• 致謝126-128
• 統(tǒng)計學(xué)審稿證明128

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本文編號：797899