本文關(guān)鍵詞：索拉非尼對(duì)腎癌細(xì)胞系786-0干性相關(guān)表達(dá)影響

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【摘要】：腎癌起病隱匿,多發(fā)現(xiàn)較晚,對(duì)于分期較晚的患者,常常需要進(jìn)行化療以延緩患者生存期,但腎癌對(duì)化療極不敏感,常規(guī)化療方案效果較差。以索拉非尼為代表的靶向藥物的出現(xiàn),曾為腎癌化療帶來(lái)希望,然而隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)索拉非尼治療晚期腎癌的遠(yuǎn)期效果欠佳,并且在其他腫瘤的靶向治療研究中發(fā)現(xiàn),不僅會(huì)伴有腫瘤耐藥出現(xiàn),還可能會(huì)增加殘存腫瘤的惡性度。腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞(CSC)的存在,是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和化療抵抗的根源,由此推測(cè)腎癌耐受靶向治療的可能原因是由于腎癌中CSC的存在。由于腫瘤干細(xì)胞多處于GO期,化療只對(duì)分裂期細(xì)胞有效,化療后存活下來(lái)的CSC蘇醒后再次進(jìn)行分化,從而致使化療失敗；CSC的識(shí)別關(guān)鍵在于篩選可靠的標(biāo)志物,已有研究證實(shí)CD133、CD34、CD105、CD44等在其他腫瘤中有不同程度表達(dá),可能與腫瘤干細(xì)胞密切相關(guān)；而CSC干性特點(diǎn)的維持依賴于某些特定基因的表達(dá),這些特定基因參與調(diào)節(jié)CSC的自我增殖、分化和耐藥,而研究證實(shí)基因Oct3/4、Bmi1、β-catenin和Nanog可能與腫瘤干細(xì)胞有不同程度相關(guān)；有研究表明腫瘤中的側(cè)群細(xì)胞(SP)被認(rèn)為是一種可能富含CSC的細(xì)胞群,能表現(xiàn)出較強(qiáng)的干細(xì)胞特性,SP細(xì)胞的篩選是基于細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCG2的表達(dá),而ABCG2不僅與SP細(xì)胞相關(guān),更與各種腫瘤的耐藥相關(guān),且被證實(shí)可能是腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物之一。另外,乏氧環(huán)境可促進(jìn)ABCG2蛋白的表達(dá),腫瘤乏氧微環(huán)境催生的乏氧因子被認(rèn)為與腫瘤的惡性度、耐藥相關(guān),可能參與腫瘤干細(xì)胞干性特點(diǎn)的維持。CSC的研究在其他腫瘤中開展較早,但腎癌干細(xì)胞的研究仍處于早期階段。本課題選用FCM、Western Blot、免疫熒光、RT-qPCR等技術(shù),分別從細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)層次,對(duì)腎癌細(xì)胞系786-0中多種可能的腫瘤干細(xì)胞相關(guān)表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),并分析了靶向藥物索拉非尼對(duì)這些表達(dá)的影響。本課題的開展將有助于拓展腎癌干細(xì)胞的研究,幫助探索腎癌耐受靶向治療的原因,為腎癌的診斷、預(yù)后判斷及化療提供新的思路和線索。第一章索拉非尼對(duì)腎癌細(xì)胞系786-O的體外抑制作用及細(xì)胞周期影響目的：探討評(píng)價(jià)靶向藥物索拉非尼對(duì)腎癌細(xì)胞系786-0的體外抑制、促進(jìn)凋亡作用及對(duì)其細(xì)胞周期的影響情況。方法：選用786-0腎癌細(xì)胞系,進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng),分別將2.5μM、5.0μM、7.5μM、10.0μM不同濃度的索拉非尼作用于細(xì)胞系,收集不同時(shí)間點(diǎn)(0h,24h,48h,72h,96h)的細(xì)胞,先選用MTS檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)及不同濃度組細(xì)胞的增殖情況,后選用FCM方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期改變。結(jié)果：1.細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果：不同作用濃度和作用時(shí)間組的細(xì)胞增殖活性檢測(cè)換算為抑制率,經(jīng)多因素析因設(shè)計(jì)資料的方差分析,濃度和時(shí)間的主效應(yīng)分析結(jié)果F值分別為：57.681、126.0,P均0.01,差異明顯；并且兩者之間存在明顯交互作用(F=4.410,P0.01)�？傮w結(jié)果提示：隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)和作用濃度的增加,索拉非尼對(duì)腎癌細(xì)胞系786-0抑制作用呈逐漸增強(qiáng)趨勢(shì),其中10.0μM濃度抑制作用最強(qiáng)。2.細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果：FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡,選用10.0μM為作用濃度,選0h、24h、48h、72h、96h點(diǎn)作為時(shí)間分組。總體凋亡率各時(shí)間組較0h對(duì)照組比較,經(jīng)方差分析F=1893.68,P0.001,24h組與對(duì)照組無(wú)明顯差別(P0.05),其余各個(gè)時(shí)間組較對(duì)照組均差別顯著(P0.05)。3.細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果：FCM檢測(cè)細(xì)胞周期,0h、24h、48h、72h、96h各時(shí)間點(diǎn)G0/G1期細(xì)胞的比例分別為：57.37±1.03%、58.82±1.34%、61.03±1.28%、64.56±2.61%、70.90±1.11%,呈逐漸增高趨勢(shì)。各時(shí)間組與Oh對(duì)照組比較,經(jīng)方差分析F=34.95,P0.001,24h組無(wú)明顯差別(P0.05),48h組開始差異顯著(P0.05),72h、96h組差異非常顯著(P0.01)。結(jié)論：索拉非尼對(duì)腎癌細(xì)胞系786-0體外抑制作用明顯,可以明顯促進(jìn)其凋亡并阻滯其分化停止于G0/G1期,從而達(dá)到腫瘤抑制的目的；而作用后G0/G1期細(xì)胞比例增加,可能與腎癌干細(xì)胞的存在相關(guān)。第二章腎癌細(xì)胞系786-O腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)及索拉非尼對(duì)其表達(dá)影響目的：探討腫瘤干細(xì)胞相關(guān)分子標(biāo)志物CD133、CD105、CD34、CD44、CD24在腎癌細(xì)胞系786-O中表達(dá),并分析靶向藥物索拉非尼對(duì)這些標(biāo)志物表達(dá)影響。方法：在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,選用FCM分別檢測(cè)胞系中腫瘤干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物CD133、 CD105、CD44、CD24、CD34的表達(dá)情況,然后選用10.0μM作為作用濃度對(duì)786-0腎癌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),再檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)(0h、24h、48h、72h、96h)各種標(biāo)志物表達(dá)改變情況。后在BALB/C-NU小鼠身上建立動(dòng)物成瘤模型,對(duì)照組和給藥組小鼠各6只,模型建立成功后選用索拉非尼對(duì)給藥組小鼠進(jìn)行連續(xù)灌胃處理,處死小鼠并處理瘤體,選用免疫熒光方法,檢測(cè)對(duì)照組與給藥組瘤體組織標(biāo)本以上標(biāo)志物表達(dá)情況。結(jié)果：1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)流式檢測(cè)：①CD133在各個(gè)時(shí)間組表達(dá)陽(yáng)性率均較低,對(duì)照組0.55±0.05%,96小時(shí)組升高至4.14±0.15%。各時(shí)間組與0h對(duì)照組比較經(jīng)方差分析F=291.585,P值0.001,24h組無(wú)明顯差別(P0.05),48h組差別顯著(P0.05),72h組和96h組差別非常顯著(P0.01)；②CD105表達(dá)陽(yáng)性率稍高,對(duì)照組4.04±0.08%,96h組升至12.36±1.23%。各時(shí)間組與0h對(duì)照組比較經(jīng)方差分析F=4.853,P0.001,24h組及48h組與對(duì)照組相比無(wú)明顯差別(P0.05),72小時(shí)組差別顯著(P0.05),96h組差別非常顯著(P0.01)；③CD34表達(dá)較低,對(duì)照組0.23±0.02%,96小時(shí)組升至1.28±0.05%。各時(shí)間組與Oh對(duì)照組比較經(jīng)方差分析F=714.105,P0.01,均差異顯著(P0.05))；④CD44在各個(gè)時(shí)間組均表達(dá)率較高,各時(shí)間組與0h對(duì)照之間比較經(jīng)方差分析,F=2.019,P0.05,差別不明顯；⑤CD24在各時(shí)間組均表達(dá)率較高,各時(shí)間組與對(duì)照組比較經(jīng)方差分析F=1.075,P=0.419,差別不明顯。2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)免疫熒光結(jié)果：動(dòng)物成瘤模型良好,采用免疫熒光方法檢測(cè)給藥組及對(duì)照組瘤體組織中CD133、CD105、CD34、CD44、CD24表達(dá),結(jié)果顯示：CD133、CD105、CD34在對(duì)照組瘤體組織表達(dá)較少,但在給藥組瘤體組織表達(dá)明顯提高；而CD44、CD24在對(duì)照組和給藥組瘤體組織均表達(dá)較高,且兩組之間無(wú)明顯區(qū)別,與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。結(jié)論：CD133、CD105、CD34在腎癌細(xì)胞系786-0存在少量表達(dá),其表達(dá)可以被索拉非尼提高,而CD44、CD24在腎癌細(xì)胞系786-0中表達(dá)陽(yáng)性率較高,且索拉非尼作用前后無(wú)明顯改變。提示CD133、CD105、CD34可能是腎癌細(xì)胞系786-0的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物,而CD44、CD24不適合。第三章：腎癌細(xì)胞系786-O腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)及索拉非尼對(duì)其表達(dá)影響目的：檢測(cè)腫瘤干細(xì)胞的相關(guān)基因Oct3/4、Bmi1、β-catenin、Nanog在腎癌細(xì)胞系786-0中的表達(dá),并探討索拉非尼對(duì)這些基因表達(dá)的影響。方法：本部分研究在第二章研究的基礎(chǔ)上,分別從細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)兩個(gè)方面,檢測(cè)腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因Oct3/4、Bmi1、β-catenin、Nanog在各組細(xì)胞和動(dòng)物瘤體組織標(biāo)本的表達(dá)情況。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,選用RT-qPCR技術(shù)首先分別檢測(cè)胞系中可疑干細(xì)胞基因表達(dá),然后選用1O.0μM索拉非尼進(jìn)行干預(yù),檢測(cè)不同時(shí)間組(0h、24h、48、72h、96h)各基因的表達(dá)改變情況。對(duì)動(dòng)物成瘤藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)所獲得的給藥組及對(duì)照組瘤體組織標(biāo)本,重復(fù)以上檢測(cè)。結(jié)果：1.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)各基因檢測(cè)結(jié)果：①Oct3/4基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量在24h、48h、72h、96h組分別為：1.21±0.10、3.28±0.35、4.38±0.41、7.55±0.36；②Bmi1基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量在24h、48h、72h、96h組分別為：1.12±0.11、2.96±0.27、6.12±0.44、10.68±0.78,③β-catenin基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量在24h、48h、72h、 96h組分別為：1.12±0.12、3.10±0.16、4.26±0.22、8.46±0.68；④Nanog基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量在24h、48h、72h、96h組分別為：1.21±0.15、1.48±0.13、4.35±0.29、6.82±0.36。各基因不同時(shí)間組與0h對(duì)照組比較經(jīng)方差分析,24h組均無(wú)明顯差異(P0.05),48h組開始差異顯著(P0.05),表達(dá)明顯增加。2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)各基因檢測(cè)結(jié)果：：①Oct3/4基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量在對(duì)照組和給藥組：1.25±0.37、9.60±3.29；②Bmi1基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量在對(duì)照組和給藥組：1.30±0.36、6.58±1.49；③β-catenin基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量在對(duì)照組和給藥組：1.06±1.36、39.27±21.89;④Nanog基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量在對(duì)照組和給藥組：0.98±0.27、77.22±24.0。各基因給藥組與對(duì)照組比較,經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),均差異顯著(P0.05)。結(jié)論：腎癌細(xì)胞系786-0中可以檢測(cè)到基因Oct3/4、β-catenin、Nanog、Bmi1不同程度的表達(dá),并且其表達(dá)水平可以被靶向藥物索拉非尼提高。提示腎癌細(xì)胞系786-0中可能存在極少量的腫瘤干細(xì)胞,而Oct3/4、β-catenin、Nanog、Bmi1基因均可能是腎癌干細(xì)胞的相關(guān)基因。第四章：索拉非尼對(duì)腎癌細(xì)胞系786-O中SP細(xì)胞比例及ABCG2、 HIF-1α、HIF-2α表達(dá)的影響目的：檢測(cè)腎癌細(xì)胞系786-0中SP細(xì)胞比例及ABCG2、HIF-1α、HIF-2α的表達(dá),探討索拉非尼對(duì)腎癌細(xì)胞系中SP細(xì)胞比例及ABCG2、HIF-1α、HIF-2α表達(dá)的影響情況。方法：本部分研究在第三章研究的基礎(chǔ)上,先選用FCM檢測(cè)了786-0腎癌細(xì)胞中SP細(xì)胞比例及索拉非尼對(duì)其不同作用時(shí)間后比例改變情況。由于ABCG2、HIF-1α、 HIF-2α與SP細(xì)胞比例及腫瘤干細(xì)胞均相關(guān),隨后在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,我們分別選用Western Blot和RT-qPCR技術(shù),從蛋白和基因水平對(duì)索拉非尼不同作用時(shí)間組細(xì)胞進(jìn)行.ABCG2、HIF-1α、HIF-2α的蛋白和基因檢測(cè)。最后,為驗(yàn)證以上細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果,對(duì)動(dòng)物成瘤模型藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)中所獲得的對(duì)照組及給藥組瘤體組織標(biāo)本,重復(fù)以上蛋白和基因水平上的檢測(cè)。結(jié)果：1.SP細(xì)胞比例檢測(cè)：對(duì)照組及24h、48h、72h、96h組SP細(xì)胞比例矯正值分別：1.06±0.05%、1.21±0.12%、2.66±0.28%、14.05±1.52%、41.27±4.74%,各個(gè)時(shí)間組與oh對(duì)照組之間比較,經(jīng)方差分析F=90.643,P0.001,24h組與對(duì)照組比較差異不明顯(P0.05),48h、72h及96h組與對(duì)照組比較差異顯著(P0.05)。2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)Western Blot結(jié)果：以GADPH作為蛋白定量?jī)?nèi)參,ABCG2、 HIF-1α、HIF-2α各自灰度值的不同時(shí)間組與0h對(duì)照組之間比較,經(jīng)方差分析F值分別為：293.85、281.956、511.717,P值均0.001,均差別明顯,提示ABCG2、 HIF-1α、HIF-2α三種蛋白在腎癌細(xì)胞系786-0中均存在表達(dá),且可以被索拉非尼明顯提高。3.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)Western Blot結(jié)果：對(duì)照組及給藥組瘤體組織標(biāo)本內(nèi)ABCG2、 HIF-1α蛋白表達(dá)灰度值比較,經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。提示ABCG2、HIF-1α蛋白在給藥組瘤體組織內(nèi)表達(dá)均較對(duì)照組內(nèi)明顯提高。而HIF-2α蛋白表達(dá)在加藥組和對(duì)照組比較兩組之間差別不明顯(P0.05)。4.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)RT-qPCR結(jié)果：ABCG2基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量在24h、48h、 96h組分別為：1.21±0.19、2.34±0.19、3.23±0.24、5.12±0.16；HIF-1α基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量在24、48h、72h、96h組分別為：1.14±0.16、3.50±0.28、7.53±0.27、10.67±0.75；HIF-2α基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量在24h、48h、72h、96h組分別為：1.29±0.15、6.39±0.40、21.44±1.75、42.37±3.66。各基因各時(shí)間組與0h對(duì)照比較,分別經(jīng)方差分析：均24h組無(wú)明顯差異(P0.05),48h、72h、96h組差異顯著(P0.05)。5.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)RT-qPCR結(jié)果：ABCG2基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量在對(duì)照組和給藥組分別為：0.89±0.21、16.27±6.62；HIF-1α基因基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量在對(duì)照組和給藥組分別為：0.98±0.35、9.60±3.29;HIF-2α基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量在對(duì)照組和給藥組分別為：1.05±0.39、6.58±1.49。各基因給藥組與對(duì)照組比較,經(jīng)獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn),均差異顯著(P0.05)結(jié)論：腎癌細(xì)胞系786-0中可以檢測(cè)到少量比例的SP細(xì)胞,并且其比例可以被索拉非尼提高。腎癌細(xì)胞系786-0中同樣可以檢測(cè)到不同程度ABGC2、HIF-1α和HIF-2α的表達(dá),且索拉非尼作用后其表達(dá)水平提高。提示所檢測(cè)到的SP細(xì)胞可能是富含腎癌干細(xì)胞的細(xì)胞群,而ABGC2、HIF-1α和HIF-2α的表達(dá)可能與腎癌細(xì)胞系786-O對(duì)索拉非尼的化療耐受相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：腎細(xì)胞癌 腫瘤干細(xì)胞 標(biāo)志物 側(cè)群細(xì)胞 乏氧誘導(dǎo)因子
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.11
【目錄】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-20
• 前言20-28
• 參考文獻(xiàn)24-28
• 第一章 索拉非尼對(duì)腎癌細(xì)胞系786-O的體外抑制作用及細(xì)胞周期的影響28-47
• 1 材料和方法28-34
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-38
• 3 討論38-42
• 4 結(jié)論42-43
• 參考文獻(xiàn)43-47
• 第二章 腎癌細(xì)胞系786-O中相關(guān)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)及索拉非尼對(duì)其表達(dá)的影響47-72
• 1 材料和方法47-52
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果52-62
• 3 討論62-67
• 4 結(jié)論67
• 參考文獻(xiàn)67-72
• 第三章 腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因在腎癌細(xì)胞系786-O中表達(dá)及索拉非尼對(duì)其表達(dá)影響72-96
• 1 材料和方法72-79
• 2 結(jié)果79-88
• 3 討論88-91
• 4 結(jié)論91
• 參考文獻(xiàn)91-96
• 第四章 索拉非尼對(duì)786-O腎癌細(xì)胞系中SP細(xì)胞比例及ABCG2、HF-1α和HIF-2α表達(dá)的影響96-131
• 1 材料和方法96-106
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果106-118
• 3 討論118-125
• 4 結(jié)論125
• 參考文獻(xiàn)125-131
• 全文小結(jié)131-133
• 英文縮略詞133-135
• 博士期間科研活動(dòng)及成果135-137
• 致謝137-138
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)證明138-139

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本文編號(hào)：796822