本文關(guān)鍵詞：Akt信號(hào)通路在膀胱腫瘤的進(jìn)展及化療敏感性的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：研究背景膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤,主要指尿路上皮癌,包括非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌和肌層浸潤(rùn)性膀胱癌。非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌是指腫瘤局限于膀胱粘膜層及粘膜下層,未侵犯肌層,約占膀胱癌的75%,又稱(chēng)為淺表性膀胱癌。目前雖然經(jīng)尿道膀胱鏡腫瘤切除配合手術(shù)后的膀胱內(nèi)灌注化療藥物,已經(jīng)成為淺表性膀胱癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法,但仍有約2/3的患者術(shù)后會(huì)出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā),并且復(fù)發(fā)患者中還會(huì)有部分病例可進(jìn)展為更高的腫瘤病理分級(jí)。肌層浸潤(rùn)性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer, MIB C)是指臨床分期為T(mén)2-T4的膀胱癌,占初發(fā)膀胱癌的25%,惡性程度高,進(jìn)展比較快,預(yù)后較差。根治性膀胱切除術(shù)(Radical Cystectomy, RC)是目前肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法,根治性膀胱切除術(shù)結(jié)合順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療已經(jīng)被用來(lái)改善晚期及浸潤(rùn)性膀胱癌患者的預(yù)后,是提高晚期和浸潤(rùn)性膀胱癌患者的生存率、降低腫瘤復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的有效方法。目前對(duì)于肌層浸潤(rùn)性膀胱癌來(lái)說(shuō),最常用的化療方法是MVAC方案(甲氨蝶呤、長(zhǎng)春新堿、多柔比星和順鉑)和GC方案(吉西他濱和順鉑)。上述方案中均含有順鉑,表明順鉑(CDDP)在化療中的重要作用。順鉑作為鉑類(lèi)抗癌藥物的代表,是膀胱癌化療方案中的主要藥物。盡管上述聯(lián)合化療方案已取得了明顯的療效,但同時(shí)也給患者帶來(lái)了比較嚴(yán)重的化療毒性反應(yīng),而且在使用一段時(shí)間后,有可能會(huì)出現(xiàn)腫瘤的化療耐藥。由于腫瘤化療耐藥性的發(fā)生,只有15-20%的病人可以獲得長(zhǎng)期生存率。因此,為克服鉑類(lèi)化療藥物的耐藥性及改善化療的有效性,尋找新的克服化療耐藥性及提高化療敏感性的分子靶向指標(biāo)已經(jīng)成為近期研究的熱點(diǎn),以求提高化療的效率,有效地減少化療的毒性,從而能夠?yàn)橥砥诮䴘?rùn)性膀胱癌患者延長(zhǎng)生存時(shí)間,改善預(yù)后,獲得更好的生活質(zhì)量。Akt,又稱(chēng)為蛋白激酶B,是P13K/Akt信號(hào)通路中重要的下游調(diào)節(jié)因子,占據(jù)著核心樞紐的地位,包括三種亞型,Akt1,Akt2和Akt3.Akt作為P13K/Akt信號(hào)通路中重要的調(diào)節(jié)因子,能夠調(diào)節(jié)下游多個(gè)效應(yīng)因子的表達(dá),如mTOR,GSK3,BAD,Bcl-2,4EBP1,70S6K等,從而調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡、蛋白合成、細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)等等。已有研究表明,Akt在正常細(xì)胞及組織中發(fā)揮著重要作用,可以調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、存活、代謝。很多學(xué)者研究顯示Akt信號(hào)通路的失調(diào)與腫瘤、糖尿病、心血管疾病及神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān),尤其是腫瘤。研究發(fā)現(xiàn)Akt通路的激活與多種腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移等息息相關(guān),包括肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、血液系統(tǒng)疾病等等,并且Akt可以通過(guò)調(diào)節(jié)下游多通路來(lái)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展。因此,Akt是P13K/Akt信號(hào)通路中的核心治療靶點(diǎn),通過(guò)調(diào)節(jié)Akt的表達(dá)來(lái)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡之間的平衡,從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)增殖,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的效果。P13K活化后激活A(yù)kt,即Akt發(fā)生磷酸化,Akt的兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)Thr308和Ser473。激活的Akt可以誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖,抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡,從而發(fā)揮促進(jìn)腫瘤發(fā)生進(jìn)展的作用。根據(jù)這一機(jī)制,目前的Akt靶向抑制劑,通過(guò)降低Akt及下游效應(yīng)分子的磷酸化水平的表達(dá),來(lái)達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。此外,Akt信號(hào)通路的激活與化療耐藥性及放療抵抗性也有密切關(guān)系。在泌尿系腫瘤中,已有研究通過(guò)免疫組織化學(xué)染色方法證實(shí)了Akt信號(hào)通路在膀胱癌組織中過(guò)表達(dá),且Akt通路的激活程度與膀胱癌的進(jìn)展密切相關(guān),即在浸潤(rùn)性膀胱癌中的Akt表達(dá)水平明顯高于非浸潤(rùn)性膀胱癌。同時(shí),Akt也與膀胱癌的預(yù)后相關(guān),伴有磷酸化Akt過(guò)表達(dá)的膀胱癌患者,生存時(shí)間明顯降低,且發(fā)生死亡的風(fēng)險(xiǎn)更高。學(xué)者Kreisberg及Shimizu等對(duì)Akt在前列腺癌的預(yù)后中起到的作用做了詳細(xì)的研究,結(jié)果表明Akt及磷酸化Akt表達(dá)水平的增高與更高的前列腺癌病理分級(jí)有關(guān),是提示前列腺癌患者不良臨床預(yù)后的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。鑒于Akt信號(hào)通路在腫瘤中的重要作用,Akt就成為了腫瘤靶向治療的焦點(diǎn),Akt抑制劑也就隨著研究的不斷進(jìn)展而產(chǎn)生。Akt抑制劑通過(guò)阻斷磷酸化Akt的表達(dá),從而抑制通路中下游多個(gè)效應(yīng)因子的活性,達(dá)到抑制腫瘤的增殖及進(jìn)展的效果。在本次研究中,我們選擇了MK2206,一種高效的變構(gòu)Akt抑制劑,MK2206已經(jīng)進(jìn)入I期臨床研究。近年來(lái),研究不僅局限在應(yīng)用單藥Akt抑制劑對(duì)腫瘤的影響,最近通過(guò)使用Akt抑制劑聯(lián)合化療藥物作用于Akt通路,已經(jīng)成為腫瘤治療研究的新熱點(diǎn)。Akt抑制劑與化療藥物可互相協(xié)同,起到更好的殺傷腫瘤細(xì)胞的作用,而且還可以聯(lián)合抑制Akt通路中的下游效應(yīng)分子來(lái)發(fā)揮拮抗腫瘤的化療耐藥及提高化療敏感性的效果。但是目前并沒(méi)有Akt抑制劑MK2206聯(lián)合順鉑對(duì)膀胱癌的療效,也沒(méi)有能否通過(guò)抑制Akt信號(hào)通路來(lái)提高膀胱癌對(duì)順鉑的敏感性和降低順鉑的耐藥性的相關(guān)性研究。在此次研究中,研究者申請(qǐng)并獲得了山東大學(xué)海外留學(xué)基金委的資助,在日本京都大學(xué)醫(yī)學(xué)研究科和山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院探討了Akt信號(hào)通路在膀胱癌的進(jìn)展、侵襲,克服腫瘤的順鉑耐藥性及提高順鉑敏感性中的重要作用及分子機(jī)制,從而為提高膀胱腫瘤的鉑類(lèi)聯(lián)合化學(xué)藥物治療效率提供了新型方法。目的本研究首先探討了Akt信號(hào)通路中多個(gè)效應(yīng)因子的表達(dá)水平與膀胱癌的進(jìn)展之間的關(guān)系,然后通過(guò)Akt靶向抑制劑MK2206對(duì)膀胱癌細(xì)胞作用后,研究MK2206在提高順鉑(CDDP)誘導(dǎo)的對(duì)腫瘤細(xì)胞毒性及凋亡中的作用,進(jìn)而為探索新的增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞化療敏感性的分子指標(biāo)及可能的加速殺傷腫瘤細(xì)胞作用機(jī)制,改善傳統(tǒng)的化療方案提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法(1)培養(yǎng)膀胱癌細(xì)胞并通過(guò)免疫印跡方法檢測(cè)各種細(xì)胞株中Akt及Akt信號(hào)通路中下游分子的表達(dá)水平,包括RT112,RT4,253J,J82, T24, UMUC3等。(2)采用細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)(四甲基偶氮唑藍(lán)法,MTT)法檢測(cè)MK2206和CDDP各自對(duì)膀胱癌細(xì)胞的抑制作用,計(jì)算CDDP的半數(shù)抑制濃度(50%inhibiting concentration,IC50),并然后通過(guò)免疫印跡方法檢測(cè)各膀胱癌細(xì)胞在MK2206和CDDP各自作用后的磷酸化Akt及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況；通過(guò)MTT檢測(cè)MK2206+CDDP的聯(lián)合治療對(duì)各膀胱癌細(xì)胞(RT112,253J,UMUC3,T24)的生長(zhǎng)抑制作用,并通過(guò)免疫印跡方法檢測(cè)聯(lián)合治療后的T24及RT112中Akt信號(hào)通路中各分子指標(biāo)的表達(dá)水平及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況,探討聯(lián)合治療中MK2206增加CDDP誘導(dǎo)的對(duì)腫瘤細(xì)胞毒性及凋亡的分子通路機(jī)制。(3)采用Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MK2206抑制浸潤(rùn)性膀胱癌細(xì)胞株UMUC3的侵襲能力,并通過(guò)免疫印跡方法檢測(cè)與侵襲有關(guān)的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)中各指標(biāo)snail,slug及ZEB1的表達(dá)水平變化,探討MK2206抑制細(xì)胞侵襲能力的作用機(jī)制。(4)采用膀胱癌細(xì)胞株RT112建立膀胱癌動(dòng)物模型(小鼠皮下腫瘤模型),研究各種藥物的體內(nèi)治療腫瘤的效果；采用腹腔注射的方法將藥物注射到小鼠體內(nèi)并分組,對(duì)照組(DMSO)、CDDP組、MK2206組、MK2206+CDDP組,觀察各組中對(duì)膀胱癌皮下腫瘤生長(zhǎng)的影響情況,并通過(guò)免疫組織化學(xué)染色的方法檢測(cè)四組動(dòng)物模型中的皮下腫瘤標(biāo)本的Ki-67表達(dá),分析各組藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制情況。結(jié)果(1)蛋白免疫印跡檢測(cè)在肌層浸潤(rùn)性膀胱癌細(xì)胞株中(253J,J82,T24, UMUC3)磷酸化Akt及下游的效應(yīng)分子表達(dá)增強(qiáng),而在非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌細(xì)胞株中(RT112,RT4)磷酸化Akt及下游的效應(yīng)分子無(wú)表達(dá)或弱表達(dá)。(2)MTT細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MK2206(500nM)聯(lián)合CDDP可以提高CDDP誘導(dǎo)的對(duì)腫瘤細(xì)胞毒性作用,從而增加膀胱癌腫瘤細(xì)胞對(duì)CDDP的敏感性。蛋白免疫印跡檢測(cè)到聯(lián)合CDDP治療,MK2206(500nM)可以增強(qiáng)CDDP引導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡效應(yīng),而這種凋亡效應(yīng)依賴(lài)于磷酸化Akt及其下游效應(yīng)分子表達(dá)水平的抑制。(3)MK2206(500nM)抑制磷酸化Akt及下游效應(yīng)分子表達(dá)水平,還可以抑制UMUC3的侵襲能力,并且抑制侵襲相關(guān)蛋白snail,slug及ZEB1的表達(dá)水平,這些指標(biāo)也與化療敏感性密切相關(guān)。(4)體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明聯(lián)合治療組(MK2206+CDDP)能抑制皮下腫瘤的生長(zhǎng)趨勢(shì),而且能明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖情況。結(jié)論(1)磷酸化Akt及下游效應(yīng)分子的表達(dá)增強(qiáng)與膀胱癌的進(jìn)展密切相關(guān)。(2)Akt靶向抑制劑MK2206可以抑制肌層浸潤(rùn)性膀胱癌細(xì)胞株的侵襲能力,抑制細(xì)胞的侵襲能力與侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)水平的降低有緊密關(guān)系。(3)Akt靶向抑制劑MK2206聯(lián)合CDDP可以通過(guò)抑制Akt表達(dá)及Akt信號(hào)通路下游各效應(yīng)分子的表達(dá)水平,來(lái)明顯增加膀胱癌細(xì)胞中順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和凋亡,這種聯(lián)合治療為克服膀胱癌的化療耐藥性提供了一種有效的新的治療思路。
【關(guān)鍵詞】：膀胱癌 順鉑 Akt信號(hào)通路 MK2206 細(xì)胞侵襲
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R737.14
【目錄】：

• 中文摘要6-11
• 英文摘要11-15
• 符號(hào)說(shuō)明15-17
• 前言17-22
• 材料和方法22-37
• 結(jié)果37-42
• 討論42-56
• 結(jié)論56-57
• 附圖57-69
• 參考文獻(xiàn)69-83
• 致謝83-84
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文84-85
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表85-86
• 英文論文186-105
• 英文論文2105-118
• 英文論文3118-121
• 英文論文4121-134
• 英文論文5134-145

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

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本文編號(hào)：785302