本文關(guān)鍵詞：5-氨基乙酰丙酸—光動力療法對食管癌轉(zhuǎn)移的影響及其機制研究

  更多相關(guān)文章： 5-氨基乙酰丙酸 光動力療法 食管癌 AG1478 LY294002 EGFR

【摘要】：惡性腫瘤是以細胞異常增生為特征的常見疾病,早期診斷和及時治療是降低腫瘤患者死亡率的關(guān)鍵。但惡性腫瘤的早期診斷和有效控制仍是醫(yī)學(xué)界的棘手問題。手術(shù)治療、放射治療與藥物治療仍是目前治療惡性腫瘤的常規(guī)手段。但這些傳統(tǒng)的治療手段常難以獲得理想效果,醫(yī)學(xué)界仍在不斷探索治療腫瘤的新方法。食管癌是常見的消化道惡性腫瘤,全世界每年大約有30多萬人死于食管癌,它的發(fā)病率和死亡率各個國家種族之間差異很大。手術(shù)治療、放射治療和化療仍是目前治療食管癌的常規(guī)手段,尤其對于晚期的食管癌患者,這些傳統(tǒng)的治療手段常難以獲得理想效果,我們?nèi)栽诓粩嗵剿髦委熓彻馨┑男路椒ā９鈩恿Ο煼?photodynamic therapy, PDT)是隨著激光醫(yī)學(xué)發(fā)展而興起的一種治療腫瘤的新方法。它通過光吸收物質(zhì)吸收對應(yīng)波長的激光能量,然后在腫瘤部位產(chǎn)生光物理和光化學(xué)反應(yīng)殺傷腫瘤。二十多年的臨床實踐醫(yī)療中,光動力療法在惡性腫瘤的治療中取得了令人矚目的成就,目前光動力治療腫瘤已經(jīng)得到了世界上許多國家的認可,它具有治療的目標專一,治療效果顯著,對正常組織傷害小等許多優(yōu)點。光動力療法應(yīng)用于惡性腫瘤的治療已有100多年的歷史。1996年美國FDA首先批準PDT用于治療晚期食管癌,目前已應(yīng)用到皮膚、頭頸部、消化道、肺癌、膀胱、肝臟、宮頸、陰道等部位的惡性腫瘤。光動力療法的核心是光敏劑,5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid, ALA)是第二代光敏劑,它是一種內(nèi)源性光敏劑,它本身不具有光敏活性,在體內(nèi)是從甘氨酸合成原卟啉Ⅸ (PpⅨ),再轉(zhuǎn)化成亞鐵血紅素過程中的中間產(chǎn)物。PpⅨ有很強的光敏活性,其最佳吸收波長在635nm,它具有毒性低、代謝快、避光時間短等優(yōu)勢,而且在腫瘤細胞的聚集濃度比周圍正常組織高10倍左右。近幾年,許多研究光動力療法的體內(nèi)和體外試驗中發(fā)現(xiàn)了凋亡和壞死這兩種不同的死亡方式,此外光動力療法還可刺激細胞內(nèi)的多種信號通路。EGFR是酪氨酸激酶受體HER家族的重要成員之一,許多研究顯示,多種實體腫瘤都存在EGFR高表達或突變,PI3K/Akt和Ras/Raf/MAPK是其重要的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,這些信號通路的激活與腫瘤細胞增殖、抗凋亡、血管形成、侵襲、轉(zhuǎn)移以及放化療拮抗等多種惡性生物學(xué)行為密切有關(guān)。PI3K是一種可使肌醇環(huán)第三位羥基磷酸化的磷脂酰肌醇激酶,由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基pllO組成。PI3K激活的機制有：活化的EGFR與調(diào)節(jié)亞基p85結(jié)合并將其磷酸化,改變PI3K的蛋白構(gòu)象,使p85對催化亞基pllO的抑制效應(yīng)減弱。Akt是分子量約為57ku的絲/蘇氨酸蛋白激酶,哺乳動物中的Akt是病毒原癌基因v-Akt的同源物。在人類多種腫瘤中,如卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、非小細胞肺癌和食管癌等,Akt常顯示過表達。蔣虹等研究發(fā)現(xiàn)Ⅱ、ⅢIa期無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的高分化食管癌組織AKT蛋白表達低于Ⅲb-Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的低分化食管癌,揭示了Akt有促進食管癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移的作用。目前已有多種EGFR靶向藥物應(yīng)用于臨床,主要由2類藥物：一種是作用于EGFR的細胞膜外區(qū)域的抗EGFR單克隆抗體,如西妥昔單抗(cetuximab)和帕尼單抗(panitumumab)等,這類藥物在細胞外與EGFR結(jié)合后抑制EGFR細胞內(nèi)的信號通路活化；另一種是EGFR細胞內(nèi)酪氨酸激酶的小分子抑制劑,如吉非替尼(gefitinib)、厄羅替尼(erlotinib)及拉帕替尼(lapatinib),是EGFR和HER2雙靶點拮抗劑,該類藥物進入細胞后結(jié)合于EGFR的酪氨酸激酶,阻斷EGFR信號通路。EGFR的小分子酪氨酸激酶抑制劑tyrphostin AG1478,是人工合成的,可特異性抑制EGFR的活化,可競爭性地與ATP位點結(jié)合,作用于EGFR的細胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū),進而阻斷EGFR及下游信號傳導(dǎo)通路。AG1478通過抑制EGFR活化,阻斷PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,從而抑制腫瘤生長。LY294002是第一個人工合成的PI3Kα/δ/β的抑制劑,LY294002使Akt/PKB失活,因此抑制細胞增殖和誘導(dǎo)細胞凋亡。有研究應(yīng)用PI3K的抑制劑LY294002作用于肺癌細胞株,發(fā)現(xiàn)Akt的活性降低,肺癌細胞出現(xiàn)凋亡,生長受到抑制,LY294002聯(lián)合化療藥物促進化療藥物的敏感性。本課題主要研究光動力療法對食管癌體內(nèi)及體外腫瘤生長轉(zhuǎn)移的影響,選用的是第二代光敏劑5-氨基乙酰丙酸(ALA),檢測食管癌活細胞在體外和體內(nèi)經(jīng)光動力作用后細胞生長轉(zhuǎn)移能力的改變,從細胞和在體水平揭示光動力引起的細胞損傷機制,以及其對EGFR/PI3K/AKT信號通路的調(diào)控機制,并創(chuàng)新性聯(lián)合ALA-PDT和EGFR抑制劑AG1478以及PI3K/AKT抑制劑LY294002后,研究其對食管癌Eca-109細胞生長遷移運動能力的影響及EGFR/PI3K/Akt信號通路基因及蛋白表達的變化�；诮沂緳C理提高療效的目的,本課題運用光動力療法與信號通路小分子抑制劑的聯(lián)合效應(yīng),探討其內(nèi)在聯(lián)系,從而為ALA-PDT和酪氨酸激酶抑制劑聯(lián)合應(yīng)用于食管癌的治療提供理論依據(jù),并期望為臨床提供新的光動力治療的模式,改變光動力治療腫瘤作用范圍有限、容易復(fù)發(fā)、遠期療效差的缺陷,提高腫瘤治療效果,這將有利于推動光動力療法的發(fā)展及其在腫瘤治療中的應(yīng)用。研究目的：1.不同劑量濃度的ALA光敏劑介導(dǎo)的光動力療法,對食管癌Eca-109細胞的生長抑制作用；2.一定濃度的ALA光敏劑介導(dǎo)的光動力療法,對食管癌Eca-109細胞體外遷移運動能力的影響；3.一定濃度的ALA光敏劑介導(dǎo)的光動力療法,對裸鼠食管癌腫瘤生長的抑制作用；4.一定濃度的ALA光敏劑介導(dǎo)的光動力治療裸鼠后,腫瘤組織內(nèi)EGFR/PI3K/AKT信號通路中的基因及蛋白表達的變化；5.一定濃度的ALA光敏劑介導(dǎo)的光動力療法聯(lián)合不同濃度的EGFR酪氨酸激酶抑制劑AG1478對食管癌Eca-109細胞的生長抑制作用；6.一定濃度的ALA光敏劑介導(dǎo)的光動力療法聯(lián)合不同濃度的PI3K/AKT抑制劑LY294002對食管癌Eca-109細胞的生長抑制作用；7.一定濃度的ALA光敏劑介導(dǎo)的光動力療法聯(lián)合一定濃度的EGFR抑制劑AG1478對食管癌Eca-109細胞體外遷移運動能力的影響；8.一定濃度的ALA光敏劑介導(dǎo)的光動力療法聯(lián)合一定濃度的PI3K/AKT抑制劑LY294002對食管癌Eca-109細胞體外遷移運動能力的影響；9.一定濃度的ALA光敏劑介導(dǎo)的光動力療法聯(lián)合一定濃度的EGFR酪氨酸激酶抑制劑AG1478對食管癌Eca-109細胞內(nèi)EGFR/PI3K/AKT信號通路中基因及蛋白表達的影響；10.一定濃度的ALA光敏劑介導(dǎo)的光動力療法聯(lián)合一定濃度的PI3K/AKT抑制劑LY294002對食管癌Eca-109細胞內(nèi)EGFR/PI3K/AKT信號通路中基因及蛋白表達的影響。研究內(nèi)容與方法：第一部分5-氨基乙酰丙酸-光動力療法對食管癌細胞體外遷移運動能力的影響1.ALA-PDT對食管癌Eca-109細胞生長增殖的抑制作用用MTT法測定不同劑量濃度的ALA光敏劑介導(dǎo)的光動力療法對食管癌細胞增殖的抑制作用,為后續(xù)的實驗選用的ALA濃度提供參考。2.ALA-PDT對食管癌Eca-109細胞體外遷移運動能力的影響用Transwell體外遷移實驗驗證ALA光敏劑介導(dǎo)的光動力療法,對食管癌Eca-109細胞體外遷移運動能力的影響。第二部分5-氨基乙酰丙酸-光動力療法對荷瘤裸鼠食管癌轉(zhuǎn)移的影響及其機制研究1.負載GFP-Eca-109細胞穩(wěn)定株的建立將攜帶GFP的慢病毒轉(zhuǎn)染Eca-109細胞,使用流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率,并用CELLQUEST軟件檢測和分析其轉(zhuǎn)染效率,使轉(zhuǎn)染效率達到90%以上,熒光顯微鏡下觀察并拍照。2.荷瘤裸鼠模型建立分別將Eca-109細胞、GFP-Eca-109細胞接種于裸鼠右后臀部皮下,飼養(yǎng)一到1-2周,建立食管癌裸鼠模型,用于后續(xù)的實驗。3.熒光成像ALA-PDT治療前、后不同時間對荷瘤裸鼠進行熒光成像,了解腫瘤治療前后的形態(tài)、大小變化及有無轉(zhuǎn)移瘤。4.ALA-PDT對荷瘤裸鼠食管癌腫瘤增殖的抑制作用對荷瘤裸鼠進行ALA-PDT治療前、后不同時間分別測量腫瘤大小,計算腫瘤體積,檢測ALA-PDT治療對裸鼠食管癌腫瘤生長的抑制作用；5. ALA-PDT對荷瘤裸鼠食管癌腫瘤組織內(nèi)EGFR/PI3K/AKT信號通路中基因表達的影響。通過熒光定量PCR的方法檢測ALA光敏劑介導(dǎo)的光動力治療裸鼠后,食管癌腫瘤組織中基因表達的變化。6. ALA-PDT對荷瘤裸鼠食管癌腫瘤組織內(nèi)EGFR/PI3K/AKT信號通路中蛋白表達的影響。通過Western blot的方法檢測ALA光敏劑介導(dǎo)的光動力治療裸鼠后,食管癌腫瘤組織中蛋白表達的變化。第三部分5-氨基乙酰丙酸-光動力療法聯(lián)合AG1478和LY294002對食管癌細胞體外遷移運動能力的影響及其機制研究1. ALA-PDT聯(lián)合AG1478對Eca-109細胞增殖的抑制作用用MTT法檢測ALA光敏劑介導(dǎo)的光動力療法聯(lián)合不同濃度的EGFR酪氨酸激酶抑制劑AG1478對食管癌Eca-109細胞生長的抑制率,并檢測不同濃度的EGFR抑制劑AG1478對食管癌Eca-109細胞生長抑制率的變化,選取最佳的與光動力療法聯(lián)合的AG1478的濃度劑量。2.ALA-PDT聯(lián)合LY294002對Eca-109細胞增殖的抑制作用用MTT法檢測ALA光敏劑介導(dǎo)的光動力療法聯(lián)合不同濃度的PI3K/AKT抑制劑LY294002對食管癌Eca-109細胞生長的抑制率,并了解不同濃度的PI3K/AKT抑制劑LY294002對食管癌Eca-109細胞生長的抑制率變化,選取最佳的與光動力療法聯(lián)合的LY294002的濃度劑量。3.ALA-PDT聯(lián)合AG1478對Eca-109細胞體外遷移運動能力的影響通過上述的試驗選擇與光動力療法聯(lián)合的AG1478最佳濃度劑量,用Transwell體外遷移實驗驗證ALA-PDT聯(lián)合AG1478對Eca-109體外遷移運動能力的影響。4.ALA-PDT聯(lián)合LY294002對Eca-109細胞體外遷移運動能力的影響通過上述的試驗選擇與光動力療法聯(lián)合的LY294002最佳濃度劑量,用Transwell體外遷移實驗驗證ALA-PDT聯(lián)合LY294002對Eca-109體外遷移運動能力的影響。5. ALA-PDT聯(lián)合AG1478或LY294002對Eca-109細胞中EGFR及下游基因的影響。通過熒光定量PCR的方法檢測ALA-PDT聯(lián)合AG1478治療后Eca-109細胞內(nèi)EGFR/PI3K/AKT通路中相關(guān)基因表達的變化；通過熒光定量PCR的方法檢測ALA-PDT聯(lián)合LY294002治療后Eca-109細胞內(nèi)EGFR/PI3K/AKT通路中相關(guān)基因表達的變化。6.ALA-PDT聯(lián)合AG1478或LY294002對Eca-109細胞中EGFR及下游蛋白的影響通過Western blot的方法檢測ALA-PDT聯(lián)合AG1478治療后Eca-109細胞內(nèi)EGFR/PI3K/AKT通路中相關(guān)蛋白表達的變化,并檢測ALA-PDT聯(lián)合LY294002治療后Eca-109細胞內(nèi)EGFR/PI3K/AKT通路中相關(guān)蛋白表達的變化。統(tǒng)計方法：所有數(shù)據(jù)采用spss13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±sd)表示。不同藥物濃度處理細胞組間的抑制率差異分析用單因素方差分析(One-Way ANOVA);實驗組與對照組Transwell小室中穿膜細胞數(shù)的差異分析用兩獨立樣本t檢驗(Independent-samples T test),組間差異用單因素方差分析；實驗組相對于對照組的基因及蛋白表達差異分析采用單樣本t檢驗(One-sample T test),或獨立樣本t檢驗,組間對比采用單因素方差分析；裸鼠腫瘤不同處理組間的瘤體積在不同時間點的差異分析用重復(fù)測量方差分析(repeated measured)。以P0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果：1.在同一光照時間和光劑量強度下,不同濃度的光敏劑ALA介導(dǎo)的光動力療法對食管癌Eca-109細胞體外生長抑制作用有顯著性差異(P0.05),在一定范圍內(nèi),ALA光敏劑濃度越高,抑制率越高。2.濃度為0.5mmol/L的光敏劑ALA介導(dǎo)的光動力療法可降低食管癌Eca-109細胞體外遷移運動能力,與對照組差異有顯著性(P0.05)。3.攜帶GFP的裸鼠經(jīng)光敏劑ALA介導(dǎo)的光動力治療后,在治療后8天到36天腫瘤生長受抑制,與空白對照組、攜帶GFP的不治療組間有顯著性差異(P0.05),而空白對照組與攜帶GFP的不治療組間腫瘤體積變化無顯著性差異(P0.05)。4.ALA介導(dǎo)的光動力治療后裸鼠腫瘤組織內(nèi)EGFR/PI3K/AKT通路中相關(guān)基因及蛋白表達下調(diào),提示ALA-PDT可能通過下調(diào)該通路中基因及蛋白的表達導(dǎo)致腫瘤生長轉(zhuǎn)移能力下降。5.不同濃度的EGFR抑制劑AG1478對食管癌Eca-109細胞的生長抑制率不同,組間有顯著性差異(P0.05),最佳抑制濃度為20ummol/L,0.5mmol/L的ALA-PDT聯(lián)合不同濃度的AG1478對食管癌Eca-109細胞的生長抑制率不同,組間有顯著性差異(P0.05),最佳聯(lián)合的抑制濃度為20ummol/L。6.不同濃度的PI3K/AKT抑制劑LY294002對食管癌Eca-109細胞的生長抑制率不同,組間有顯著性差異(P0.05),最佳抑制濃度為20ummol/L,0.5mmol/L的5-ALA-PDT聯(lián)合不同濃度的LY294002對食管癌Eca-109細胞的生長抑制率不同,組間有顯著性差異(P0.05),最佳聯(lián)合的抑制濃度為20ummol/L。7.0.5mmol/L的ALA-PDT聯(lián)合20umol/L的AG1478可降低食管癌細胞體外遷移運動能力,與單純ALA-PDT和空白對照組間有顯著性差異(P0.05)。8.0.5mmol/L的ALA-PDT聯(lián)合20umol/L的LY294002可降低食管癌細胞體外遷移運動能力,與單純ALA-PDT和空白對照組間有顯著性差異(P0.05)。9.ALA-PDT作用于Eca-109細胞后,細胞中EGFR基因表達顯著下調(diào),ALA-PDT聯(lián)合AG1478作用于Eca-109細胞后,細胞中的EGFR基因及蛋白下調(diào)較對照組差異有顯著性(P0.05)。10.ALA-PDT聯(lián)合LY294002作用于Eca-109細胞后,細胞中的AKT基因及蛋白下調(diào),較對照組差異有顯著性(P0.05)。結(jié)論：本研究首先從體外實驗驗證了光敏劑ALA介導(dǎo)的光動力療法可抑制食管癌細胞的生長遷移能力,然后成功構(gòu)建了攜帶GFP荷瘤裸鼠模型,以ALA-PDT治療裸鼠食管癌腫瘤,結(jié)果顯示,ALA-PDT治療可降低裸鼠腫瘤的生長速度,并檢測了裸鼠食管癌腫瘤組織內(nèi)EGFR/PI3K/AKT信號通路中的基因及蛋白表達變化,揭示了ALA-PDT降低食管癌的生長轉(zhuǎn)移能力的分子機制。通過體內(nèi)外的實驗,揭示了ALA-PDT可下調(diào)EGFR/PI3K/AKT信號通路基因和蛋白的表達,再進一步應(yīng)用EGFR抑酪氨酸激酶制劑AG1478、PI3K/AKT抑制劑LY294002與ALA-PDT聯(lián)合作用于Eca-109細胞,發(fā)現(xiàn)ALA-PDT分別與兩種抑制劑聯(lián)合后,可進一步下調(diào)EGFR/PI3K/AKT信號通路中的相關(guān)基因和蛋白的表達,降低食管癌Eca-109細胞體外生長遷移的能力。綜上所述,本課題通過闡明ALA介導(dǎo)的光動力療法對食管癌體內(nèi)和體外生長轉(zhuǎn)移能力的影響及其調(diào)控EGFR/PI3K/AKT信號通路的分子機制,明確了ALA-PDT抗腫瘤的分子機制,并進一步創(chuàng)新性應(yīng)用新的光動力療法,即聯(lián)合應(yīng)用EGFR/PI3K/AKT信號通路的小分子抑制劑,增強ALA-PDT的殺傷力,有助于推動光動力療法這一新型腫瘤治療方法的進展。
【關(guān)鍵詞】：5-氨基乙酰丙酸 光動力療法 食管癌 AG1478 LY294002 EGFR
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.1
【目錄】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-23
• 前言23-31
• 參考文獻29-31
• 第一章 5-氨基乙酰丙酸-光動力療法對食管癌細胞體外遷移運動能力的影響31-46
• 1.1 材料與方法31-38
• 1.2 統(tǒng)計學(xué)方法38
• 1.3 結(jié)果38-41
• 1.4 結(jié)論41
• 1.5 討論41-43
• 參考文獻43-46
• 第二章 5-氨基乙酰丙酸-光動力療法對荷瘤裸鼠食管癌轉(zhuǎn)移的影響及其機制研究46-81
• 2.1 材料與方法46-62
• 2.2 統(tǒng)計學(xué)方法62-63
• 2.3 結(jié)果63-76
• 2.4 結(jié)論76-77
• 2.5 討論77-79
• 參考文獻79-81
• 第三章 5-氨基乙酰丙酸-光動力療法聯(lián)合AG1478和LY294002對食管癌細胞體外遷移運動能力的影響及其機制研究81-113
• 3.1 材料與方法81-99
• 3.2 統(tǒng)計學(xué)方法99
• 3.3 結(jié)果99-107
• 3.4 結(jié)論107-108
• 3.5 討論108-110
• 參考文獻110-113
• 全文小結(jié)113-115
• 中英文縮略詞表115-116
• 學(xué)習(xí)期間發(fā)表的論文116-117
• 致謝117-120
• 統(tǒng)計學(xué)證明120

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本文編號：766742