本文關(guān)鍵詞：CAT-1作為一種新的細(xì)胞粘附分子介導(dǎo)了內(nèi)皮完整性和L-arginine轉(zhuǎn)運(yùn)

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【摘要】：研究背景：心腦血管疾病如冠心病、高血壓、腦卒中、肺動(dòng)脈高壓等是人類健康的主要?dú)⑹�。尋找其有效的干預(yù)措施,是關(guān)系國計(jì)民生的迫切需求。該組疾病病因復(fù)雜,大多由遺傳及環(huán)境等多因素所致,但內(nèi)皮完整性受損和內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是該組疾病發(fā)生的早期關(guān)鍵環(huán)節(jié)。內(nèi)皮細(xì)胞連接是內(nèi)皮完整性的分子基礎(chǔ),在調(diào)節(jié)血管功能方面發(fā)揮了重要的作用。在多細(xì)胞生物中,細(xì)胞連接對于許多生物功能是必需的,如形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞分化、增殖、凋亡和遷移。超微結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)皮細(xì)胞有三種類型細(xì)胞連接,即間隙連接(GJs)、緊密連接(TJs)和粘附連接(AJs)。相鄰細(xì)胞之間的GJs可以形成跨膜通道,而TJs和AJs則通過跨膜同嗜性粘附作用沿細(xì)胞邊緣形成細(xì)胞外拉鏈結(jié)構(gòu)。在三種內(nèi)皮細(xì)胞連接中,AJs是其主要類型,鈣粘蛋白(cadherins)和連接素(nectins)是已知的AJs之一。然而,針對這些已知分子的干預(yù)措施并不能完全阻斷上述病理狀態(tài)下的內(nèi)皮通透性增加及完整性受損。CAT-1分子家族的第一個(gè)成員(小鼠CAT-1, mCAT-1)最初被鑒定為莫洛尼鼠白血病病毒受體(MuLVR)。氨基酸序列同源比較及氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能實(shí)驗(yàn)揭示CAT-1亦是一種鈉離子依賴的陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從而介導(dǎo)了陽離子氨基酸如L-arginine (L-Arg)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。L-Arg是細(xì)胞NO合成的唯一前體物質(zhì),在內(nèi)皮細(xì)胞中CAT-1作為L-Arg的主要跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,通過介導(dǎo)胞外L-Arg的跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)從而增加內(nèi)皮細(xì)胞NO產(chǎn)生濃度。NO是一多功能生物活性分子,它通過調(diào)節(jié)血管平滑肌張力、抑制白細(xì)胞及血小板與血管內(nèi)皮粘附、抑制血管平滑肌細(xì)胞的增生及向內(nèi)膜遷移,在維持血管生理功能中發(fā)揮重要作用。另外,NO通過調(diào)節(jié)多種血管介質(zhì)影響血管內(nèi)皮通透性調(diào)節(jié),過量表達(dá)NO后會(huì)增加內(nèi)皮通透性。最近研究顯示,CAT-1在心血管系統(tǒng)疾病中發(fā)揮著重要作用,比如其過表達(dá)可以緩解氧化應(yīng)激性內(nèi)皮病理過程和肥胖導(dǎo)致的高血壓等。但是,CAT-1對于血管內(nèi)皮完整性的研究尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。鑒于過表達(dá)CAT-1可以增加內(nèi)皮細(xì)胞NO的生成,而過量產(chǎn)生的NO又會(huì)增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性,因此我們猜想CAT-1過表達(dá)會(huì)增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性、損傷內(nèi)皮完整性。但是,根據(jù)我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,CAT-1過表達(dá)增加了NO的生成,但是并沒有增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性,相反,降低CAT-1表達(dá)后反而增加內(nèi)皮通透性。因此,內(nèi)皮細(xì)胞CAT-1可能通過一種不依賴于NO的其他機(jī)制參與了內(nèi)皮穩(wěn)定性調(diào)節(jié),比如穩(wěn)定內(nèi)皮細(xì)胞連接等。因此,本課題旨在通過構(gòu)建CAT-1/GFP融合蛋白,研究CAT-1通過何種機(jī)制維持了內(nèi)皮通透性。研究目的：1、構(gòu)建CAT-1/GFP融合表達(dá)蛋白,并評價(jià)該融合蛋白是否具有野生型CAT-1相一致的生物學(xué)功能；2、分析CAT-1是否通過穩(wěn)定內(nèi)皮細(xì)胞連接維持了內(nèi)皮的完整性；3、驗(yàn)證CAT-1是否具有細(xì)胞粘附分子的生化特點(diǎn)及功能特征；4、探討CAT-1轉(zhuǎn)運(yùn)底物L(fēng)-Arg對其發(fā)揮氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞連接功能的影響。研究方法：第一部分：1.利用PCR方法從內(nèi)皮細(xì)胞克隆獲取CAT-1基因序列,將基因片段亞克隆至pENTR1A/GFP穿梭質(zhì)粒形成CAT-1/GFP融合基因穿梭載體,然后采用Gateway LR重組技術(shù)構(gòu)建獲得腺病毒載體pAd-CAT-1/GFP和慢病毒載體pLenti-CAT-1/GFP,分別轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞和293FT細(xì)胞生產(chǎn)病毒,最后感染PAEC細(xì)胞和CHO-S細(xì)胞建立過表達(dá)CAT-1的細(xì)胞模型；2. CAT-1/GFP腺病毒感染豬肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(PAEC),采用同位素方法檢測L-Arg轉(zhuǎn)運(yùn)和NO生成,評價(jià)CAT-1/GFP融合蛋白是否具有野生型CAT-1一致的生物學(xué)功能；3.活細(xì)胞共聚焦顯微鏡觀察CAT-1在PAEC細(xì)胞的表達(dá)及亞細(xì)胞定位；4. Western blot用以檢測CAT-1/GFP的單體-二聚體(mono-dimer)形式；蛋白交聯(lián)劑BS3處理CHO-S懸浮細(xì)胞,并通過Western blot檢測CAT-1二聚體形式是反式(trans)還是順式(cis)結(jié)合：5.建立穩(wěn)定表達(dá)CAT-1/GFP融合蛋白的CHO-S細(xì)胞系,采用細(xì)胞凝集反應(yīng)檢測CAT-1是否具有促進(jìn)細(xì)胞同源粘附的功能；第二部分：1.利用伊文氏藍(lán)-白蛋白(EB-albumin)作為示蹤劑,單層內(nèi)皮細(xì)胞通透性實(shí)驗(yàn)用以分析CAT-1對內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響；2.活體細(xì)胞共聚焦顯微鏡分析L-Arg處理對CAT-1介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞連接及其亞細(xì)胞定位的影響。研究結(jié)果：第一部分：1、酶切鑒定及序列測序分析證實(shí)CAT-1克隆序列以及CAT-1/GFP融合表達(dá)基因正確無誤,并且成功包裝了腺病毒和慢病毒；2、CAT-1/GFP融合蛋白具有與CAT-1一致的生物學(xué)功能成功提取并培養(yǎng)了PAEC細(xì)胞,經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察及第八因子抗原染色(Ⅷ-RAg),細(xì)胞純度大于95%；PAEC細(xì)胞過表達(dá)CAT-1/GFP后,與表達(dá)GFP對照細(xì)胞比較,其L-Arg轉(zhuǎn)運(yùn)能力增加了9倍(P0.01),NO生成水平升高了5倍(P0.01),說明重組的CAT-1/GFP融合蛋白具有與野生型CAT-1一致的功能；3、CAT-1蛋白主要定位在內(nèi)皮細(xì)胞-細(xì)胞連接部位PAEC細(xì)胞表達(dá)CAT-1/GFP,利用共聚焦顯微鏡通過綠色熒光可以發(fā)現(xiàn)CAT-1/GFP主要定位在細(xì)胞-細(xì)胞連接部位,細(xì)胞核周圍的熒光表示新生成的蛋白；CAT-1/GFP表達(dá)水平在48-72h達(dá)到高峰,可以維持至少7d；同時(shí),免疫細(xì)胞熒光染色證實(shí)野生型CAT-1也有細(xì)胞-細(xì)胞連接部位的定位。提示CAT-1可能是一種細(xì)胞粘附分子。4、CAT-1蛋白具有反式同源二聚體的特點(diǎn)采用4-20%SDS-PAGE梯度分離膠分析蛋白樣品,可見CAT-1/GFP有兩種形式存在,一種是大小為190KD的二聚體形式,另一種是大小為95KD的單聚體形式,說明CAT-1/GFP可以發(fā)生同源二聚；而利用BS3蛋白交聯(lián)劑處理單個(gè)懸浮CHO-S細(xì)胞,CAT-1/GFP蛋白條帶是單一條帶(95KD),表明CAT-1/GFP的同源二聚體形式是反式結(jié)合。說明CAT-1具有細(xì)胞粘附分子的生化特征。5、CAT-1蛋白具有促進(jìn)懸浮CHO-S細(xì)胞同源粘附的功能用CAT-1/GFP及GFP對照慢病毒分別感染CHO-S細(xì)胞,blastidin抗生素篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株,細(xì)胞凝集反應(yīng)實(shí)驗(yàn)顯示CAT-1/GFP表達(dá)細(xì)胞株比GFP表達(dá)細(xì)胞株更容易發(fā)生凝集現(xiàn)象(P0.05)。除此之外,CAT家族其他幾個(gè)成員,比如CAT-2b、CAT-3和CAT-4也具有促進(jìn)細(xì)胞凝集反應(yīng)的特點(diǎn),而CAT-4不具有氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能,說明CATs家族促進(jìn)細(xì)胞同源粘附與其氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)能力無關(guān)。進(jìn)一步證實(shí)CAT-1是一種細(xì)胞粘附分子。第二部分：1.降低內(nèi)皮細(xì)胞CAT-1表達(dá)水平增加內(nèi)皮通透性利用小干擾RNA降低內(nèi)皮細(xì)胞CAT-1表達(dá)后,EB-albumin通透率升高26±6%,與對照組細(xì)胞比較,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；而過表達(dá)CAT-1/GFP后,EB-albumin通透率降低趨勢,但是沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,可能機(jī)制是內(nèi)皮細(xì)胞基底水平的CAT-1或其它粘附分子足以維持內(nèi)皮細(xì)胞完整性；2. L-Arg處理會(huì)降低CAT-1內(nèi)置、抑制內(nèi)皮細(xì)胞CAT-1介導(dǎo)的細(xì)胞連接分離給予內(nèi)皮細(xì)胞1mM劑量的L-Arg處理后,與對照組細(xì)胞比較,CAT-1/GFP組細(xì)胞CAT-1內(nèi)置降低,細(xì)胞-細(xì)胞連接分離明顯減慢,L-Arg轉(zhuǎn)運(yùn)能力明顯增加(P0.01),并且同時(shí)有CAT-1的膜轉(zhuǎn)位現(xiàn)象發(fā)生。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明L-Arg具有穩(wěn)定內(nèi)皮細(xì)胞連接的功能,同時(shí)也為解釋氨基酸悖論(L-Arg paradox)和反式刺激(trans-stimulation)現(xiàn)象提供了新的依據(jù)。研究結(jié)論：1.融合蛋白CAT-1/GFP具有與野生型CAT-1一致的生物學(xué)功能,因此可利用抗GFP抗體和綠色細(xì)胞熒光研究CAT-1蛋白的亞細(xì)胞定位和功能；2.CAT-1是一種新的細(xì)胞粘附分子,通過穩(wěn)定內(nèi)皮細(xì)胞-細(xì)胞連接維持了內(nèi)皮的完整性；3. L-Arg通過抑制CAT-1蛋白內(nèi)置穩(wěn)定了CAT-1介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞-細(xì)胞連接：4. L-Arg抑制CAT-1內(nèi)置以及促進(jìn)細(xì)胞游離面CAT-1表達(dá),揭示了氨基酸反式刺激和L-Arg悖論現(xiàn)象的新機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：CAT-1 細(xì)胞粘附分子 內(nèi)皮細(xì)胞 細(xì)胞凝集反應(yīng) 內(nèi)皮通透性 反式刺激 L-Arg悖論
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R54;R743
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-15
• 符號說明15-16
• 第一部分：CAT-1是一種新的內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子16-62
• 前言16-20
• 1 材料與方法20-37
• 2 結(jié)果37-39
• 3 討論39-43
• 4 創(chuàng)新點(diǎn)43
• 5 局限性43
• 6 結(jié)論43-44
• 附圖44-55
• 參考文獻(xiàn)55-62
• 第二部分：CAT-1介導(dǎo)了單層內(nèi)皮完整性和L-arginine轉(zhuǎn)運(yùn)62-92
• 前言62-64
• 1 材料與方法64-70
• 2 結(jié)果70-71
• 3 討論71-74
• 4 創(chuàng)新點(diǎn)74-75
• 5 局限性75
• 6 結(jié)論75-76
• 附圖76-83
• 參考文獻(xiàn)83-92
• 英文格式畢業(yè)論文92-171
• 致謝171-172
• 附件172

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：746071