本文關(guān)鍵詞：基于轉(zhuǎn)錄組芯片篩選的新型LncRNA在CAD早期診斷中的作用及分子機制研究

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【摘要】：第一部分研究背景和目的:心血管疾病仍然是當前人類死亡的主要原因之一,而動脈粥樣硬化(AS)及其血栓形成又是導致心血管疾病的主要原因。在心臟,AS引起冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(CAD),盡管目前針對CAD的治療有效,主要包括調(diào)脂治療和以PCI(經(jīng)皮冠狀動脈介入)或CABG(冠狀動脈旁路搭橋手術(shù))術(shù)后聯(lián)合抗凝和(或)抗血小板治療為代表的血運重建,但是CAD的死亡率仍維持高位。CAD早期診斷可能有助于及早干預,取得良好預后。因此,及早診斷CAD意義重大。近年來,隨著全基因組分析技術(shù)的快速發(fā)展,研究發(fā)現(xiàn)幾乎所有人類的基因組都能轉(zhuǎn)錄并且產(chǎn)生大量長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNAs,lnc RNAs)。Lnc RNAs是一類長度大于200nt,甚至超過10knt的不能編碼蛋白的RNA分子。研究發(fā)現(xiàn)lnc RNA可通過表觀遺傳,轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等多個層面調(diào)控基因表達,參與疾病病理生理過程,如腫瘤,自身免疫性疾病和神經(jīng)功能紊亂等。最近研究表明,一些lnc RNAs參與包括心臟衰竭,心肌肥大,心臟代謝疾病、心肌梗塞和AS等各種類型心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。同時,一些lnc RNAs還可作為許多疾病的診斷及判斷預后的生物標志物,例如尿液中前列腺特異性的linc RNA PCA可用來診斷前列腺癌,血漿里的lnc RNA HULC可用于檢測肝細胞癌,H19可診斷胃癌,LIPCAR可準確預測心梗后心衰病人的預后。但是,目前還沒有關(guān)于循環(huán)血液中的lnc RNA作為早期診斷CAD的生物標志物的報道。近來CAD被認為是一種慢性炎性疾病,主要累及大-中肌型動脈,以動脈粥樣硬化斑塊形成為特征。已有研究證實在外周血中占粒細胞總數(shù)約5-10%的單核細胞在AS形成這一病理過程中發(fā)揮重要作用。本課題將系統(tǒng)地研究CAD病人單核細胞在轉(zhuǎn)錄組表達譜的變化,篩選新型CAD相關(guān)的長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lnc RNA),建立早期診斷CAD的"lnc RNA分子診斷模型",并對該模型的準確性和有效性進行驗證。在此基礎(chǔ)之上,研究其生物學功能,全面評估其在CAD發(fā)生發(fā)展中的作用。方法:第一章本研究共入選了502例在本科介入中心接受冠脈造影的CAD及對照患者,病人的相關(guān)臨床資料完整。采用lnc RNA表達譜芯片對15例男性CAD病人和15例男性對照患者單核細胞和血漿進行研究,采用實時定量PCR方法在相同的單核細胞樣本里驗證了芯片結(jié)果,接著我們又在另一個20×20的人群對篩選的3個lnc RNAs進行了驗證及ROC曲線分析。我們進一步擴大樣本量(211×171)對Coro Marker與CAD之間的關(guān)系進行病例對照研究,并隨機抽樣分為訓練樣本161×121和驗證樣本(50×50),根據(jù)訓練樣本構(gòu)建"Coro Marker分子Fisher判別模型",同時對對照研究人群、訓練樣本和驗證樣本分別進行ROC曲線分析和危險因素分析。同時,在一個獨立人群(50×40)進行前瞻性的診斷研究。最后,在不同心血管疾病中對其特異性檢測。第二章根據(jù)芯片結(jié)果,篩選差異基因并對其進行GO、Pathway、共表達網(wǎng)絡(luò)及功能富集分析,同時,在體外應用電轉(zhuǎn)的方法,特異性si RNA敲降Coro Marker的表達,觀察THP-1細胞增殖及炎性細胞因子分泌等生物學行為的變化。結(jié)果:第一章根據(jù)lnc RNA表達譜芯片結(jié)果,我們成功篩選到51個在CAD病人單核細胞和血漿中同時高表達的lnc RNAs,進一步篩選出其中5個差異顯著高豐度表達的lnc RNAs,在(20×20)人群中,采用q PCR及ROC曲線分析方法分析得到在CAD病人單核細胞中高表達的3個lnc RNA(Coro Marker,IL21R和BAT5),AUC分別為0.94、0.825和0.818,故確定Coro Marker為研究對象。在接下來的臨床大樣本(211×171)驗證過程中,根據(jù)最優(yōu)抽樣效果構(gòu)建Coro Marker的Fisher判別模型,Fisher判別函數(shù):f=-3.05212x+4.648898。x為Coro Marker的表達值,當x=1.523時,該個體就是CAD患者,x1.523時,則為非CAD患者。樣本集模型(100次抽樣對應的100個模型)判斷結(jié)果提示:平均正確判別率為0.81,最大正判率為0.89,最小正判率為0.74;其中,冠心病組平均正判率為0.65,最大正判率為0.82,最小正判率為0.50;而對照組平均正判率為0.97,最大正判率為1.00,最小正判率為0.90。冠心病平均正判32例,誤判為對照組18例;對照組平均正判48例,誤判為冠心病2例。該模型判斷最優(yōu)結(jié)果提示:分類總正判率為0.89,其中冠心病組達到0.80,對照組高達0.98。冠心病組正判40例,誤判為對照組10例,對照組正判高達49例,誤判為冠心病只有1例。而ROC分析結(jié)果表明總體樣本中AUC為0.92,95%CI(0.892-0.947),而第15次抽樣對應的訓練樣本及驗證樣本中AUC分別為0.905,95%CI(0.869-0.940)和0.96,95%CI(0.923-0.997)。危險因素分析結(jié)果提示Coro Marker不受CAD傳統(tǒng)危險因素的影響,單因素及多因素分析結(jié)果提示Coro Marker可作為診斷CAD的獨立危險因素。獨立前瞻性研究結(jié)果提示,該模型能夠分別在50例CAD病人中正判38例,在40例對照組患者中正判37例,相應的敏感性和特異性分別為76%和92.5%。相較其他的心血管疾病,Coro Marker在CAD中特異性高表達。第二章根據(jù)芯片結(jié)果,篩選得到差異基因共556個,GO分析發(fā)現(xiàn),上調(diào)差異基因主要參與signal transduction,small molecule metabolic process和transmembrane transport等相關(guān)細胞生理功能,而下調(diào)差異基因的功能注釋主要表現(xiàn)在small molecule metabolic process,inflammatory response,lipopolysaccharide-mediated signaling pathway和lipid metabolic process等過程。Pathway分析提示,冠心病組外周血單核細胞上調(diào)差異基因主要參與Jak-STAT signaling pathway,Vascular smooth muscle contraction,Leukocyte transendothelial migration和Metabolic pathways等細胞信號轉(zhuǎn)導途徑,而下調(diào)差異基因主要參與Rheumatoid arthritis,Chemokine signaling pathway,Toll-like receptor signaling pathway,Antigen processing and presentation,Metabolic pathways和Apoptosis等與炎癥、免疫和凋亡相關(guān)的細胞信號轉(zhuǎn)導途徑。相關(guān)基因功能富集分析表明,在相關(guān)系數(shù)r≥0.99,FDR≤7.61E-05的情況下,在外周血單核細胞差異基因中篩選出35個編碼蛋白的m RNA與Coro Marker正相關(guān)。對這35個m RNAs的生理功能進行GO分析,發(fā)現(xiàn)其功能主要富集在信號轉(zhuǎn)導和小分子代謝等方面;運用同樣的方法,我們分析在r-0.900,FDR≤9.83E-05的情況下,篩選出33個編碼蛋白的m RNA與Coro Marker負相關(guān)。對這33個負相關(guān)m RNAs的生理功能進行GO分析,提示其功能主要富集在先天免疫、細胞因子介導的信號途徑和凋亡過程介導的信號途徑等。體外功能實驗研究結(jié)果表明,THP-1細胞中Coro Marker的表達降低可以顯著減弱THP-1細胞的增殖能力,同時也降低炎性細胞因子IL-1β、IL6和TNFα的分泌。結(jié)論:(1)首次篩選出CAD病人單核細胞高表達的Coro Marker。(2)建立了lnc RNA的"Coro Marker分子診斷模型",可早期預測CAD的發(fā)生發(fā)展。(3)Coro Marker可通過促進單核細胞增殖和分泌炎性細胞因子導致CAD的病理形成。第二部分研究背景和目的:在第一部分研究工作中,我們證實單核細胞高豐度表達的Coro Marker可作為早期診斷CAD的一個新型生物標志物;在功能初步驗證中,研究分析Coro Marker可通過發(fā)揮促炎和促單核細胞增殖的作用導致CAD發(fā)生發(fā)展。同時,我們研究發(fā)現(xiàn)CAD病人單核細胞里高豐度表達的Coro Marker并不能很好解釋其在血漿里的高豐度表達,相關(guān)性分析結(jié)果R2=0.276,提示血漿里Coro Marker僅部分來源于單核細胞,Coro Marker存在其他來源途徑。近年來研究表明,動脈血管內(nèi)皮在血管穩(wěn)態(tài)的維持方面扮演重要分泌器官的角色,通過分泌多種物質(zhì),發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用,維持血管穩(wěn)態(tài)。前期預實驗結(jié)果提示Coro Marker在HUVEC高豐度表達,我們合理推測可能由各種危險因素引起血管內(nèi)皮功能失調(diào),致內(nèi)皮細胞分泌大量Coro Marker入血,導致CAD的發(fā)生發(fā)展。本實驗的目的就是探討CAD病人動脈血管內(nèi)皮高豐度表達的Coro Marker在CAD病理形成中的作用及分子機制。方法:第一章我們運用percoll液分選外周血循環(huán)內(nèi)皮細胞,通過q PCR方法研究循環(huán)內(nèi)皮細胞Coro Marker在CAD組和非CAD組之間的差異表達;在HUVEC細胞系上,構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)sh RNA-Coro Marker細胞系;ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液中相關(guān)炎性細胞因子IL-1β、IL-6和TNFα的分泌。第二章運用熒光原位雜交和核質(zhì)分離的方法研究Coro Marker在內(nèi)皮細胞中的亞定位;3‘及5‘RACE和northern blot的方法獲取并驗證Coro Marker的全長序列;生物信息學分析Coro Marker可能的作用,并用雙熒光素酶報告基因的方法研究Coro Marker與mir205-5P的直接作用;Wester Blot及q PCR的方法研究基因在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后的表達。結(jié)果:第一章q PCR結(jié)果表明Coro Marker在冠心病人循環(huán)內(nèi)皮細胞上的表達(5.156±0.896),95%CI(0.565,1.397),較對照組患者循環(huán)內(nèi)皮細胞上的表達(0.981±0.176),95%CI(3.036,7.275),顯著升高(P0.05);對Coro Marker的功能進行研究,在成功干擾Coro Marker 70%的時候,ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中炎性細胞因子IL-1β、IL6和TNFα的結(jié)果提示Coro Marker干擾組IL-1β(P=0.0398)、IL6(P=0.000)和TNFα(P=0.017)的分泌較對照組和陰性對照組,皆顯著降低(P0.05),而IL-1β、IL6和TNFα在對照組和陰性對照組之間無明顯差異(P0.05),n=6。第二章熒光原位雜交實驗結(jié)果提示,帶cy3標記的Coro Marker主要集中在HUVEC細胞的胞漿中;核質(zhì)分離實驗的結(jié)果進一步證實胞漿中Coro Marker的表達是細胞核中的2.5倍。在HUVEC細胞上,分別通過3‘和5‘RACE,獲取了Coro Marker的全長序列,共有1394nt;并通過Northern blot實驗進一步證實Coro Marker基因條帶對應在1500bp附近,和RACE結(jié)果一致。繼而生物信息學分析提示Coro Marker可以和micro RNA205-5P互補結(jié)合;q PCR研究結(jié)果表明干擾Coro Marker組micro RNA205-5P的表達較對照組及干擾陰性對照組皆顯著下降(P0.05);雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果提示,lnc RNA可顯著增強mi R-205的表達(P0.05),luciferase活性較對照組增強近2倍。q PCR及WB檢測結(jié)果皆表明作為micro RNA205-5P靶基因的PTEN在Coro Marker干擾組中顯著上調(diào),同時干擾PTEN可使Coro Marker促進炎性細胞因子的分泌得到部分恢復。結(jié)論:(1)首次成功鑒定出CAD的致病基因Coro Marker.(2)首次證明Coro Marker主要分布在細胞漿中,并可直接調(diào)控micro RNA205-5P的啟動子。(3)首次證明了Coro Marker-micro RNA205-5P-PTEN這一信號通路在CAD發(fā)生發(fā)展中的作用。
【關(guān)鍵詞】：冠心病 長鏈非編碼RNA 診斷 生物標志物 外周血單核細胞 冠心病 長鏈非編碼RNA micro RNA PTEN 內(nèi)皮細胞
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R541.4
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 英文摘要7-15
• 中文摘要15-20
• 第一部分 單核細胞lnc RNA作為診斷CAD新型分子標志物的篩選及其功能研究20-88
• 第一章 前言20-24
• 第二章 lnc RNA-Coro Marker作為早期診斷冠心病的新型分子標志物的篩選，診斷模型的建立24-70
• 2.1 材料和方法24-32
• 2.2 實驗結(jié)果32-67
• 2.3 討論67-69
• 2.4 小結(jié)69-70
• 第三章 Coro Marker的功能分析及驗證70-88
• 3.1 材料與方法70-76
• 3.2 實驗結(jié)果76-84
• 3.3 討論84-87
• 3.4 小結(jié)87-88
• 第二部分 內(nèi)皮細胞Coro Marker在CAD發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機制研究88-136
• 第一章 前言88-91
• 第二章 內(nèi)皮細胞Coro Marker在CAD發(fā)生發(fā)展中的作用及功能研究91-104
• 2.1 實驗材料與方法91-98
• 2.2 實驗結(jié)果98-102
• 2.3 討論102-103
• 2.4 小結(jié)103-104
• 第三章 內(nèi)皮細胞Coro Marker在CAD發(fā)生發(fā)展中的分子機制研究104-136
• 3.1 材料與方法104-124
• 3.2 實驗結(jié)果124-134
• 3.3 討論134-135
• 3.4 小結(jié)135-136
• 全文總結(jié)136-137
• 參考文獻137-145
• 文獻綜述 RNA干擾療法在心血管疾病中的應用145-156
• 參考文獻151-156
• 攻讀博士期間發(fā)表的論文156-157
• 致謝157

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本文編號：754181