本文關(guān)鍵詞：基于轉(zhuǎn)錄組芯片篩選的新型LncRNA在CAD早期診斷中的作用及分子機(jī)制研究

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【摘要】：第一部分研究背景和目的:心血管疾病仍然是當(dāng)前人類死亡的主要原因之一,而動(dòng)脈粥樣硬化(AS)及其血栓形成又是導(dǎo)致心血管疾病的主要原因。在心臟,AS引起冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(CAD),盡管目前針對(duì)CAD的治療有效,主要包括調(diào)脂治療和以PCI(經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入)或CABG(冠狀動(dòng)脈旁路搭橋手術(shù))術(shù)后聯(lián)合抗凝和(或)抗血小板治療為代表的血運(yùn)重建,但是CAD的死亡率仍維持高位。CAD早期診斷可能有助于及早干預(yù),取得良好預(yù)后。因此,及早診斷CAD意義重大。近年來(lái),隨著全基因組分析技術(shù)的快速發(fā)展,研究發(fā)現(xiàn)幾乎所有人類的基因組都能轉(zhuǎn)錄并且產(chǎn)生大量長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNAs,lnc RNAs)。Lnc RNAs是一類長(zhǎng)度大于200nt,甚至超過(guò)10knt的不能編碼蛋白的RNA分子。研究發(fā)現(xiàn)lnc RNA可通過(guò)表觀遺傳,轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等多個(gè)層面調(diào)控基因表達(dá),參與疾病病理生理過(guò)程,如腫瘤,自身免疫性疾病和神經(jīng)功能紊亂等。最近研究表明,一些lnc RNAs參與包括心臟衰竭,心肌肥大,心臟代謝疾病、心肌梗塞和AS等各種類型心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。同時(shí),一些lnc RNAs還可作為許多疾病的診斷及判斷預(yù)后的生物標(biāo)志物,例如尿液中前列腺特異性的linc RNA PCA可用來(lái)診斷前列腺癌,血漿里的lnc RNA HULC可用于檢測(cè)肝細(xì)胞癌,H19可診斷胃癌,LIPCAR可準(zhǔn)確預(yù)測(cè)心梗后心衰病人的預(yù)后。但是,目前還沒(méi)有關(guān)于循環(huán)血液中的lnc RNA作為早期診斷CAD的生物標(biāo)志物的報(bào)道。近來(lái)CAD被認(rèn)為是一種慢性炎性疾病,主要累及大-中肌型動(dòng)脈,以動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成為特征。已有研究證實(shí)在外周血中占粒細(xì)胞總數(shù)約5-10%的單核細(xì)胞在AS形成這一病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本課題將系統(tǒng)地研究CAD病人單核細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜的變化,篩選新型CAD相關(guān)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lnc RNA),建立早期診斷CAD的"lnc RNA分子診斷模型",并對(duì)該模型的準(zhǔn)確性和有效性進(jìn)行驗(yàn)證。在此基礎(chǔ)之上,研究其生物學(xué)功能,全面評(píng)估其在CAD發(fā)生發(fā)展中的作用。方法:第一章本研究共入選了502例在本科介入中心接受冠脈造影的CAD及對(duì)照患者,病人的相關(guān)臨床資料完整。采用lnc RNA表達(dá)譜芯片對(duì)15例男性CAD病人和15例男性對(duì)照患者單核細(xì)胞和血漿進(jìn)行研究,采用實(shí)時(shí)定量PCR方法在相同的單核細(xì)胞樣本里驗(yàn)證了芯片結(jié)果,接著我們又在另一個(gè)20×20的人群對(duì)篩選的3個(gè)lnc RNAs進(jìn)行了驗(yàn)證及ROC曲線分析。我們進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量(211×171)對(duì)Coro Marker與CAD之間的關(guān)系進(jìn)行病例對(duì)照研究,并隨機(jī)抽樣分為訓(xùn)練樣本161×121和驗(yàn)證樣本(50×50),根據(jù)訓(xùn)練樣本構(gòu)建"Coro Marker分子Fisher判別模型",同時(shí)對(duì)對(duì)照研究人群、訓(xùn)練樣本和驗(yàn)證樣本分別進(jìn)行ROC曲線分析和危險(xiǎn)因素分析。同時(shí),在一個(gè)獨(dú)立人群(50×40)進(jìn)行前瞻性的診斷研究。最后,在不同心血管疾病中對(duì)其特異性檢測(cè)。第二章根據(jù)芯片結(jié)果,篩選差異基因并對(duì)其進(jìn)行GO、Pathway、共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)及功能富集分析,同時(shí),在體外應(yīng)用電轉(zhuǎn)的方法,特異性si RNA敲降Coro Marker的表達(dá),觀察THP-1細(xì)胞增殖及炎性細(xì)胞因子分泌等生物學(xué)行為的變化。結(jié)果:第一章根據(jù)lnc RNA表達(dá)譜芯片結(jié)果,我們成功篩選到51個(gè)在CAD病人單核細(xì)胞和血漿中同時(shí)高表達(dá)的lnc RNAs,進(jìn)一步篩選出其中5個(gè)差異顯著高豐度表達(dá)的lnc RNAs,在(20×20)人群中,采用q PCR及ROC曲線分析方法分析得到在CAD病人單核細(xì)胞中高表達(dá)的3個(gè)lnc RNA(Coro Marker,IL21R和BAT5),AUC分別為0.94、0.825和0.818,故確定Coro Marker為研究對(duì)象。在接下來(lái)的臨床大樣本(211×171)驗(yàn)證過(guò)程中,根據(jù)最優(yōu)抽樣效果構(gòu)建Coro Marker的Fisher判別模型,Fisher判別函數(shù):f=-3.05212x+4.648898。x為Coro Marker的表達(dá)值,當(dāng)x=1.523時(shí),該個(gè)體就是CAD患者,x1.523時(shí),則為非CAD患者。樣本集模型(100次抽樣對(duì)應(yīng)的100個(gè)模型)判斷結(jié)果提示:平均正確判別率為0.81,最大正判率為0.89,最小正判率為0.74;其中,冠心病組平均正判率為0.65,最大正判率為0.82,最小正判率為0.50;而對(duì)照組平均正判率為0.97,最大正判率為1.00,最小正判率為0.90。冠心病平均正判32例,誤判為對(duì)照組18例;對(duì)照組平均正判48例,誤判為冠心病2例。該模型判斷最優(yōu)結(jié)果提示:分類總正判率為0.89,其中冠心病組達(dá)到0.80,對(duì)照組高達(dá)0.98。冠心病組正判40例,誤判為對(duì)照組10例,對(duì)照組正判高達(dá)49例,誤判為冠心病只有1例。而ROC分析結(jié)果表明總體樣本中AUC為0.92,95%CI(0.892-0.947),而第15次抽樣對(duì)應(yīng)的訓(xùn)練樣本及驗(yàn)證樣本中AUC分別為0.905,95%CI(0.869-0.940)和0.96,95%CI(0.923-0.997)。危險(xiǎn)因素分析結(jié)果提示Coro Marker不受CAD傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素的影響,單因素及多因素分析結(jié)果提示Coro Marker可作為診斷CAD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。獨(dú)立前瞻性研究結(jié)果提示,該模型能夠分別在50例CAD病人中正判38例,在40例對(duì)照組患者中正判37例,相應(yīng)的敏感性和特異性分別為76%和92.5%。相較其他的心血管疾病,Coro Marker在CAD中特異性高表達(dá)。第二章根據(jù)芯片結(jié)果,篩選得到差異基因共556個(gè),GO分析發(fā)現(xiàn),上調(diào)差異基因主要參與signal transduction,small molecule metabolic process和transmembrane transport等相關(guān)細(xì)胞生理功能,而下調(diào)差異基因的功能注釋主要表現(xiàn)在small molecule metabolic process,inflammatory response,lipopolysaccharide-mediated signaling pathway和lipid metabolic process等過(guò)程。Pathway分析提示,冠心病組外周血單核細(xì)胞上調(diào)差異基因主要參與Jak-STAT signaling pathway,Vascular smooth muscle contraction,Leukocyte transendothelial migration和Metabolic pathways等細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,而下調(diào)差異基因主要參與Rheumatoid arthritis,Chemokine signaling pathway,Toll-like receptor signaling pathway,Antigen processing and presentation,Metabolic pathways和Apoptosis等與炎癥、免疫和凋亡相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。相關(guān)基因功能富集分析表明,在相關(guān)系數(shù)r≥0.99,FDR≤7.61E-05的情況下,在外周血單核細(xì)胞差異基因中篩選出35個(gè)編碼蛋白的m RNA與Coro Marker正相關(guān)。對(duì)這35個(gè)m RNAs的生理功能進(jìn)行GO分析,發(fā)現(xiàn)其功能主要富集在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和小分子代謝等方面;運(yùn)用同樣的方法,我們分析在r-0.900,FDR≤9.83E-05的情況下,篩選出33個(gè)編碼蛋白的m RNA與Coro Marker負(fù)相關(guān)。對(duì)這33個(gè)負(fù)相關(guān)m RNAs的生理功能進(jìn)行GO分析,提示其功能主要富集在先天免疫、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)途徑和凋亡過(guò)程介導(dǎo)的信號(hào)途徑等。體外功能實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,THP-1細(xì)胞中Coro Marker的表達(dá)降低可以顯著減弱THP-1細(xì)胞的增殖能力,同時(shí)也降低炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL6和TNFα的分泌。結(jié)論:(1)首次篩選出CAD病人單核細(xì)胞高表達(dá)的Coro Marker。(2)建立了lnc RNA的"Coro Marker分子診斷模型",可早期預(yù)測(cè)CAD的發(fā)生發(fā)展。(3)Coro Marker可通過(guò)促進(jìn)單核細(xì)胞增殖和分泌炎性細(xì)胞因子導(dǎo)致CAD的病理形成。第二部分研究背景和目的:在第一部分研究工作中,我們證實(shí)單核細(xì)胞高豐度表達(dá)的Coro Marker可作為早期診斷CAD的一個(gè)新型生物標(biāo)志物;在功能初步驗(yàn)證中,研究分析Coro Marker可通過(guò)發(fā)揮促炎和促單核細(xì)胞增殖的作用導(dǎo)致CAD發(fā)生發(fā)展。同時(shí),我們研究發(fā)現(xiàn)CAD病人單核細(xì)胞里高豐度表達(dá)的Coro Marker并不能很好解釋其在血漿里的高豐度表達(dá),相關(guān)性分析結(jié)果R2=0.276,提示血漿里Coro Marker僅部分來(lái)源于單核細(xì)胞,Coro Marker存在其他來(lái)源途徑。近年來(lái)研究表明,動(dòng)脈血管內(nèi)皮在血管穩(wěn)態(tài)的維持方面扮演重要分泌器官的角色,通過(guò)分泌多種物質(zhì),發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用,維持血管穩(wěn)態(tài)。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示Coro Marker在HUVEC高豐度表達(dá),我們合理推測(cè)可能由各種危險(xiǎn)因素引起血管內(nèi)皮功能失調(diào),致內(nèi)皮細(xì)胞分泌大量Coro Marker入血,導(dǎo)致CAD的發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)的目的就是探討CAD病人動(dòng)脈血管內(nèi)皮高豐度表達(dá)的Coro Marker在CAD病理形成中的作用及分子機(jī)制。方法:第一章我們運(yùn)用percoll液分選外周血循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞,通過(guò)q PCR方法研究循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞Coro Marker在CAD組和非CAD組之間的差異表達(dá);在HUVEC細(xì)胞系上,構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)sh RNA-Coro Marker細(xì)胞系;ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中相關(guān)炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNFα的分泌。第二章運(yùn)用熒光原位雜交和核質(zhì)分離的方法研究Coro Marker在內(nèi)皮細(xì)胞中的亞定位;3‘及5‘RACE和northern blot的方法獲取并驗(yàn)證Coro Marker的全長(zhǎng)序列;生物信息學(xué)分析Coro Marker可能的作用,并用雙熒光素酶報(bào)告基因的方法研究Coro Marker與mir205-5P的直接作用;Wester Blot及q PCR的方法研究基因在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)。結(jié)果:第一章q PCR結(jié)果表明Coro Marker在冠心病人循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)(5.156±0.896),95%CI(0.565,1.397),較對(duì)照組患者循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)(0.981±0.176),95%CI(3.036,7.275),顯著升高(P0.05);對(duì)Coro Marker的功能進(jìn)行研究,在成功干擾Coro Marker 70%的時(shí)候,ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL6和TNFα的結(jié)果提示Coro Marker干擾組IL-1β(P=0.0398)、IL6(P=0.000)和TNFα(P=0.017)的分泌較對(duì)照組和陰性對(duì)照組,皆顯著降低(P0.05),而IL-1β、IL6和TNFα在對(duì)照組和陰性對(duì)照組之間無(wú)明顯差異(P0.05),n=6。第二章熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,帶cy3標(biāo)記的Coro Marker主要集中在HUVEC細(xì)胞的胞漿中;核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)胞漿中Coro Marker的表達(dá)是細(xì)胞核中的2.5倍。在HUVEC細(xì)胞上,分別通過(guò)3‘和5‘RACE,獲取了Coro Marker的全長(zhǎng)序列,共有1394nt;并通過(guò)Northern blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)Coro Marker基因條帶對(duì)應(yīng)在1500bp附近,和RACE結(jié)果一致。繼而生物信息學(xué)分析提示Coro Marker可以和micro RNA205-5P互補(bǔ)結(jié)合;q PCR研究結(jié)果表明干擾Coro Marker組micro RNA205-5P的表達(dá)較對(duì)照組及干擾陰性對(duì)照組皆顯著下降(P0.05);雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果提示,lnc RNA可顯著增強(qiáng)mi R-205的表達(dá)(P0.05),luciferase活性較對(duì)照組增強(qiáng)近2倍。q PCR及WB檢測(cè)結(jié)果皆表明作為micro RNA205-5P靶基因的PTEN在Coro Marker干擾組中顯著上調(diào),同時(shí)干擾PTEN可使Coro Marker促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的分泌得到部分恢復(fù)。結(jié)論:(1)首次成功鑒定出CAD的致病基因Coro Marker.(2)首次證明Coro Marker主要分布在細(xì)胞漿中,并可直接調(diào)控micro RNA205-5P的啟動(dòng)子。(3)首次證明了Coro Marker-micro RNA205-5P-PTEN這一信號(hào)通路在CAD發(fā)生發(fā)展中的作用。
【關(guān)鍵詞】：冠心病 長(zhǎng)鏈非編碼RNA 診斷 生物標(biāo)志物 外周血單核細(xì)胞 冠心病 長(zhǎng)鏈非編碼RNA micro RNA PTEN 內(nèi)皮細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R541.4
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-7
• 英文摘要7-15
• 中文摘要15-20
• 第一部分 單核細(xì)胞lnc RNA作為診斷CAD新型分子標(biāo)志物的篩選及其功能研究20-88
• 第一章 前言20-24
• 第二章 lnc RNA-Coro Marker作為早期診斷冠心病的新型分子標(biāo)志物的篩選，診斷模型的建立24-70
• 2.1 材料和方法24-32
• 2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-67
• 2.3 討論67-69
• 2.4 小結(jié)69-70
• 第三章 Coro Marker的功能分析及驗(yàn)證70-88
• 3.1 材料與方法70-76
• 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果76-84
• 3.3 討論84-87
• 3.4 小結(jié)87-88
• 第二部分 內(nèi)皮細(xì)胞Coro Marker在CAD發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機(jī)制研究88-136
• 第一章 前言88-91
• 第二章 內(nèi)皮細(xì)胞Coro Marker在CAD發(fā)生發(fā)展中的作用及功能研究91-104
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法91-98
• 2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果98-102
• 2.3 討論102-103
• 2.4 小結(jié)103-104
• 第三章 內(nèi)皮細(xì)胞Coro Marker在CAD發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制研究104-136
• 3.1 材料與方法104-124
• 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果124-134
• 3.3 討論134-135
• 3.4 小結(jié)135-136
• 全文總結(jié)136-137
• 參考文獻(xiàn)137-145
• 文獻(xiàn)綜述 RNA干擾療法在心血管疾病中的應(yīng)用145-156
• 參考文獻(xiàn)151-156
• 攻讀博士期間發(fā)表的論文156-157
• 致謝157

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本文編號(hào)：754181