發(fā)布時間：2017-08-25 00:41

  本文關(guān)鍵詞：Micro-RNA21在高糖誘導(dǎo)巨噬細胞凋亡中作用的研究

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【摘要】：背景微小RNA (MicroRNA, miRNA)最先是由Ruvkun G在線蟲中發(fā)現(xiàn)的具有調(diào)節(jié)細胞發(fā)育時序功能的小分子RNA。多項研究已證明,miRNAs參與了細胞增殖、分化、凋亡、腫瘤形成等多種生物學(xué)過程的基因表達與調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)microRNA-21(miR-21)在多種心血管疾病中的表達均增加,并參與了細胞增殖和分化等過程。研究發(fā)現(xiàn)在動脈粥樣斑塊中miR-21的表達上調(diào),但miR-21參與粥樣硬化的機制仍需進一步研究。巨噬細胞在易損斑塊形成、發(fā)展及破裂中的作用已被廣泛研究,巨噬細胞凋亡的機制目前尚在研究中,目前的研究發(fā)現(xiàn)多種信號傳導(dǎo)通路參與了巨噬細胞的凋亡。研究發(fā)現(xiàn)miR-21可通過下調(diào)PDCD4的表達來促進細胞增殖。另外,miR-21的過表達可以抑制正常細胞凋亡信號傳導(dǎo),抑制miR-21可促進細胞凋亡。因此,由miR-21介導(dǎo)的細胞凋亡可能是粥樣硬化形成的一個機制,同時miR-21可能參與了巨噬細胞凋亡的過程。糖尿病病人冠狀動脈粥樣硬化的發(fā)生率顯著增加,同時糖尿病也是心血管疾病發(fā)生的重要危險因素。既往研究發(fā)現(xiàn)巨噬細胞凋亡在糖尿病病人冠狀動脈易損斑塊形成中起重要作用。MiR-21是否參與了高濃度葡萄糖狀態(tài)下的巨噬細胞凋亡過程尚未見報道。目的研究miR-21在高濃度葡萄糖作用下巨噬細胞中的表達情況,并探討miR-21在高濃度葡萄糖刺激下抑制巨噬細胞凋亡的作用機制。方法1.細胞培養(yǎng)及處理：應(yīng)用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,培養(yǎng)Raw264.7細胞50ml細胞培養(yǎng)瓶中,37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育。細胞生長至近匯合狀態(tài)時用細胞刮刀刮除細胞,重新種植于6孔或12孔板中。Raw264.7細胞生長至融合的70%-80%時,換1%血清的DMEM培養(yǎng)液,37℃繼續(xù)孵育過夜,使細胞進入生長靜止期,隨后進行干預(yù)。應(yīng)用不同濃度的葡萄糖(5.5mmol/L、 25mmol/L)及甘露醇(25mmol/L)分別處理Raw264.7細胞24小時。2.實時定量PCR方法：應(yīng)用實時定量PCR (RT-PCR)方法檢測Raw264.7細胞miR-21及PDCD4、 Caspase-3、PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,磷酸酶基因)mRNA的表達情況。3.寡核苷酸轉(zhuǎn)染：應(yīng)用miR-21抑制劑轉(zhuǎn)染Raw264.7細胞。4. Western Blot分析：檢測PDCD4、 PTEN、 Caspase-3蛋白在細胞中的表達情況。5.流式細胞儀分析：應(yīng)用流式細胞儀檢測巨噬細胞的凋亡情況。結(jié)果1.為研究高濃度葡萄糖對巨噬細胞中miR-21表達的調(diào)節(jié)作用,Raw264.7細胞在無血清的狀態(tài)下,用25mmol/L葡萄糖和25mmol/L甘露醇分別刺激細胞0h、1h、3h、 6h、12h、 24h后收集細胞,檢測miR-21的表達量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),HG可有效刺激Raw264.7細胞miR-21表達上調(diào),而甘露醇高滲刺激巨噬細胞miR-21表達降低。HG刺激巨噬細胞miR-21表達增加上調(diào)還隨刺激時間的增加而逐漸增加,提示HG刺激巨噬細胞miR-21表達的上調(diào)呈時間依賴性。與甘露醇高滲組相比,HG處理細胞1h后miR-21表達開始明顯增加(P0.01),6h時miR-21表達達到高峰(P0.01),12h后表達開始降低。2.為了研究HG對Raw264.7細胞中PDCD4 mRNA表達的影響,Raw264.7細胞用葡萄糖和甘露醇分別處理細胞Oh、6h、12h、 24h、48h、72h后,檢測PDCD4 mRNA的表達量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在12h時HG刺激使Raw264.7細胞PDCD4 mRNA表達量明顯下降(P0.05),24h之后其mRNA表達量開始增加(P0.01),而甘露醇在6h時可引起PDCD mRNA顯著增加(P0.01),之后對PDCD4的作用不明顯。這表明HG對巨噬細胞PDCD4 mRNA表達的影響也刺激時間有關(guān),12h之前降低其表達,之后表達增加。Western Blot進一步證實,HG處理巨噬細胞12h后,PDCD4蛋白表達量亦顯著增加。本實驗同時發(fā)現(xiàn),HG可引起巨噬細胞PTEN mRNA和蛋白表達在12h內(nèi)PTEN表達量明顯下降(P0.05)。3.為了研究高濃度葡萄糖對巨噬細胞凋亡的影響,Raw264.7細胞分別用HG和甘露醇孵育不用時間后(0h、24h、48h),用裂解細胞提取細胞蛋白質(zhì),western blot檢測活化caspase-3的蛋白表達量。結(jié)果顯示,與甘露醇組相比,HG能明顯增加活化caspase-3蛋白表達量。HG處理Raw264.7細胞24h后,活化caspase-3蛋白表達量開始明顯增加,48h時表達量增加更明顯。HG處理Raw264.7細胞0h、24h、48h后,流式細胞儀檢測巨噬細胞的凋亡情況。結(jié)果表明,與對照組相比,HG組巨噬細胞的凋亡明顯增加,且呈時間依賴性。本實驗同時發(fā)現(xiàn),隨著HG刺激時間的延長,壞死的細胞也逐漸增多。4.本研究應(yīng)用miR-21抑制劑抑制Raw264.7細胞miR-21的表達后,再檢測PDCD4和PTEN的mRNA和蛋白表達情況。結(jié)果顯示,miR-21抑制劑巨噬細胞24h后,與對照組相比,miR-21的表達明顯降低(P0.01). Real-time PCR結(jié)果顯示,與對照組相比,Raw264.7細胞轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑24h后,其PDCD4 mRNA表達量明顯增加(P0.01),這提示miR-21可以抑制PDCD4的表達；HG刺激組PDCD4 mRNA表達明顯降低(P0.05),進一步證實了HG能夠降低PDCD4的表達。與HG刺激的對照組相比,miR-21抑制劑抑制細胞miR-21表達24h后再加入HG刺激細胞12h后的PDCD4 mRNA表達量也明顯增加(P0.05)。與單純miR-21抑制劑組相比,抑制miR-21的巨噬細胞經(jīng)HG處理后,其PDCD4的表達明顯降低(P0.01)。Western Blot的結(jié)果與Real-time PCR結(jié)果相同。與對照組相比,HG處理巨噬細胞后其PTEN的表達明顯減低(PO.05)；miR-21抑制組的巨噬細胞PTEN含量則明顯增加(P0.01)。與HG處理的對照組相比,抑制miR-21的巨噬細胞經(jīng)HG處理后,其PTEN的表達亦增加(P0.05),與單純miR-21抑制組性比,其PTEN的表達明顯降低(P0.01)。結(jié)論1.miR-21在高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的Raw264.7巨噬細胞中表達增加,這種表達上調(diào)呈時間依賴性。2.miR-21通過調(diào)節(jié)其靶基因PDCD4對高濃度葡萄糖誘發(fā)的巨噬細胞凋亡起保護效應(yīng)。背景心血管疾病是我國目前人群死亡的首位死亡原因,近年來我國冠心病的發(fā)生率及死亡率逐漸上升。研究表明,血清總膽固醇及低密度脂蛋白膽固醇水平的升高是冠心病和缺血性腦卒中發(fā)生的獨立危險因素之一,因此,對高膽固醇血癥患者的防治必須給予高度重視。3-羥基-3-甲基戊二^莞窤還原酶抑制劑(HMG-CoA),俗稱"他汀類",可通過抑制肝細胞內(nèi)的膽固醇合成限速酶,降低膽固醇的合成,并通過增加低密度脂蛋白受體的表法來降低循環(huán)中低密度脂蛋白的水平。研究表明,患者從他汀類藥物的臨床獲益絕大部分是通過其降脂作用,同時送些藥物可在心血管疾病的多方面發(fā)揮其非降脂作用,包括改善內(nèi)膜功能、增強動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性、降低氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng),抑制血管壁的血拴形成、抑制心肌纖維化等。研究表明高膽固醇血癥患者心房纖顫的發(fā)生率X椄�。左心房訉憿存器功能、管禂rδ薌爸Ρ霉δ芩腿齬δ，

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