本文關(guān)鍵詞：Micro-RNA21在高糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡中作用的研究

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【摘要】：背景微小RNA (MicroRNA, miRNA)最先是由Ruvkun G在線蟲中發(fā)現(xiàn)的具有調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育時(shí)序功能的小分子RNA。多項(xiàng)研究已證明,miRNAs參與了細(xì)胞增殖、分化、凋亡、腫瘤形成等多種生物學(xué)過程的基因表達(dá)與調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)microRNA-21(miR-21)在多種心血管疾病中的表達(dá)均增加,并參與了細(xì)胞增殖和分化等過程。研究發(fā)現(xiàn)在動(dòng)脈粥樣斑塊中miR-21的表達(dá)上調(diào),但miR-21參與粥樣硬化的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。巨噬細(xì)胞在易損斑塊形成、發(fā)展及破裂中的作用已被廣泛研究,巨噬細(xì)胞凋亡的機(jī)制目前尚在研究中,目前的研究發(fā)現(xiàn)多種信號(hào)傳導(dǎo)通路參與了巨噬細(xì)胞的凋亡。研究發(fā)現(xiàn)miR-21可通過下調(diào)PDCD4的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞增殖。另外,miR-21的過表達(dá)可以抑制正常細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo),抑制miR-21可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此,由miR-21介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能是粥樣硬化形成的一個(gè)機(jī)制,同時(shí)miR-21可能參與了巨噬細(xì)胞凋亡的過程。糖尿病病人冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生率顯著增加,同時(shí)糖尿病也是心血管疾病發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素。既往研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞凋亡在糖尿病病人冠狀動(dòng)脈易損斑塊形成中起重要作用。MiR-21是否參與了高濃度葡萄糖狀態(tài)下的巨噬細(xì)胞凋亡過程尚未見報(bào)道。目的研究miR-21在高濃度葡萄糖作用下巨噬細(xì)胞中的表達(dá)情況,并探討miR-21在高濃度葡萄糖刺激下抑制巨噬細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。方法1.細(xì)胞培養(yǎng)及處理：應(yīng)用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,培養(yǎng)Raw264.7細(xì)胞50ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。細(xì)胞生長至近匯合狀態(tài)時(shí)用細(xì)胞刮刀刮除細(xì)胞,重新種植于6孔或12孔板中。Raw264.7細(xì)胞生長至融合的70%-80%時(shí),換1%血清的DMEM培養(yǎng)液,37℃繼續(xù)孵育過夜,使細(xì)胞進(jìn)入生長靜止期,隨后進(jìn)行干預(yù)。應(yīng)用不同濃度的葡萄糖(5.5mmol/L、 25mmol/L)及甘露醇(25mmol/L)分別處理Raw264.7細(xì)胞24小時(shí)。2.實(shí)時(shí)定量PCR方法：應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR (RT-PCR)方法檢測Raw264.7細(xì)胞miR-21及PDCD4、 Caspase-3、PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,磷酸酶基因)mRNA的表達(dá)情況。3.寡核苷酸轉(zhuǎn)染：應(yīng)用miR-21抑制劑轉(zhuǎn)染Raw264.7細(xì)胞。4. Western Blot分析：檢測PDCD4、 PTEN、 Caspase-3蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)情況。5.流式細(xì)胞儀分析：應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測巨噬細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果1.為研究高濃度葡萄糖對巨噬細(xì)胞中miR-21表達(dá)的調(diào)節(jié)作用,Raw264.7細(xì)胞在無血清的狀態(tài)下,用25mmol/L葡萄糖和25mmol/L甘露醇分別刺激細(xì)胞0h、1h、3h、 6h、12h、 24h后收集細(xì)胞,檢測miR-21的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),HG可有效刺激Raw264.7細(xì)胞miR-21表達(dá)上調(diào),而甘露醇高滲刺激巨噬細(xì)胞miR-21表達(dá)降低。HG刺激巨噬細(xì)胞miR-21表達(dá)增加上調(diào)還隨刺激時(shí)間的增加而逐漸增加,提示HG刺激巨噬細(xì)胞miR-21表達(dá)的上調(diào)呈時(shí)間依賴性。與甘露醇高滲組相比,HG處理細(xì)胞1h后miR-21表達(dá)開始明顯增加(P0.01),6h時(shí)miR-21表達(dá)達(dá)到高峰(P0.01),12h后表達(dá)開始降低。2.為了研究HG對Raw264.7細(xì)胞中PDCD4 mRNA表達(dá)的影響,Raw264.7細(xì)胞用葡萄糖和甘露醇分別處理細(xì)胞Oh、6h、12h、 24h、48h、72h后,檢測PDCD4 mRNA的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在12h時(shí)HG刺激使Raw264.7細(xì)胞PDCD4 mRNA表達(dá)量明顯下降(P0.05),24h之后其mRNA表達(dá)量開始增加(P0.01),而甘露醇在6h時(shí)可引起PDCD mRNA顯著增加(P0.01),之后對PDCD4的作用不明顯。這表明HG對巨噬細(xì)胞PDCD4 mRNA表達(dá)的影響也刺激時(shí)間有關(guān),12h之前降低其表達(dá),之后表達(dá)增加。Western Blot進(jìn)一步證實(shí),HG處理巨噬細(xì)胞12h后,PDCD4蛋白表達(dá)量亦顯著增加。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn),HG可引起巨噬細(xì)胞PTEN mRNA和蛋白表達(dá)在12h內(nèi)PTEN表達(dá)量明顯下降(P0.05)。3.為了研究高濃度葡萄糖對巨噬細(xì)胞凋亡的影響,Raw264.7細(xì)胞分別用HG和甘露醇孵育不用時(shí)間后(0h、24h、48h),用裂解細(xì)胞提取細(xì)胞蛋白質(zhì),western blot檢測活化caspase-3的蛋白表達(dá)量。結(jié)果顯示,與甘露醇組相比,HG能明顯增加活化caspase-3蛋白表達(dá)量。HG處理Raw264.7細(xì)胞24h后,活化caspase-3蛋白表達(dá)量開始明顯增加,48h時(shí)表達(dá)量增加更明顯。HG處理Raw264.7細(xì)胞0h、24h、48h后,流式細(xì)胞儀檢測巨噬細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果表明,與對照組相比,HG組巨噬細(xì)胞的凋亡明顯增加,且呈時(shí)間依賴性。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn),隨著HG刺激時(shí)間的延長,壞死的細(xì)胞也逐漸增多。4.本研究應(yīng)用miR-21抑制劑抑制Raw264.7細(xì)胞miR-21的表達(dá)后,再檢測PDCD4和PTEN的mRNA和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示,miR-21抑制劑巨噬細(xì)胞24h后,與對照組相比,miR-21的表達(dá)明顯降低(P0.01). Real-time PCR結(jié)果顯示,與對照組相比,Raw264.7細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑24h后,其PDCD4 mRNA表達(dá)量明顯增加(P0.01),這提示miR-21可以抑制PDCD4的表達(dá)；HG刺激組PDCD4 mRNA表達(dá)明顯降低(P0.05),進(jìn)一步證實(shí)了HG能夠降低PDCD4的表達(dá)。與HG刺激的對照組相比,miR-21抑制劑抑制細(xì)胞miR-21表達(dá)24h后再加入HG刺激細(xì)胞12h后的PDCD4 mRNA表達(dá)量也明顯增加(P0.05)。與單純miR-21抑制劑組相比,抑制miR-21的巨噬細(xì)胞經(jīng)HG處理后,其PDCD4的表達(dá)明顯降低(P0.01)。Western Blot的結(jié)果與Real-time PCR結(jié)果相同。與對照組相比,HG處理巨噬細(xì)胞后其PTEN的表達(dá)明顯減低(PO.05)；miR-21抑制組的巨噬細(xì)胞PTEN含量則明顯增加(P0.01)。與HG處理的對照組相比,抑制miR-21的巨噬細(xì)胞經(jīng)HG處理后,其PTEN的表達(dá)亦增加(P0.05),與單純miR-21抑制組性比,其PTEN的表達(dá)明顯降低(P0.01)。結(jié)論1.miR-21在高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的Raw264.7巨噬細(xì)胞中表達(dá)增加,這種表達(dá)上調(diào)呈時(shí)間依賴性。2.miR-21通過調(diào)節(jié)其靶基因PDCD4對高濃度葡萄糖誘發(fā)的巨噬細(xì)胞凋亡起保護(hù)效應(yīng)。背景心血管疾病是我國目前人群死亡的首位死亡原因,近年來我國冠心病的發(fā)生率及死亡率逐漸上升。研究表明,血清總膽固醇及低密度脂蛋白膽固醇水平的升高是冠心病和缺血性腦卒中發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一,因此,對高膽固醇血癥患者的防治必須給予高度重視。3-羥基-3-甲基戊二^莞窤還原酶抑制劑(HMG-CoA),俗稱"他汀類",可通過抑制肝細(xì)胞內(nèi)的膽固醇合成限速酶,降低膽固醇的合成,并通過增加低密度脂蛋白受體的表法來降低循環(huán)中低密度脂蛋白的水平。研究表明,患者從他汀類藥物的臨床獲益絕大部分是通過其降脂作用,同時(shí)送些藥物可在心血管疾病的多方面發(fā)揮其非降脂作用,包括改善內(nèi)膜功能、增強(qiáng)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性、降低氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng),抑制血管壁的血拴形成、抑制心肌纖維化等。研究表明高膽固醇血癥患者心房纖顫的發(fā)生率X椄�。左心房訉憿存器功能、管禂rδ薌爸Ρ霉δ芩腿齬δ，

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