發(fā)布時間：2017-08-22 23:37

  本文關(guān)鍵詞：GPR137對胰腺癌生長侵襲轉(zhuǎn)移性影響及其調(diào)控機(jī)制研究

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【摘要】：胰腺癌是一種常見的消化道惡性腫瘤。近年來胰腺癌的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)明顯的上升趨勢,其惡性程度高,侵襲能力強(qiáng),是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計,在經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)以及工業(yè)化程度偏高的地區(qū),胰腺癌的發(fā)病率明顯偏高,美國胰腺癌的致死率位于惡性腫瘤中的第四位。在中國,隨著經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展,環(huán)境的不斷惡化以及人們生活方式的改變,胰腺癌的發(fā)病率也呈現(xiàn)逐年上升趨勢。雖然已經(jīng)存在大量與胰腺癌相關(guān)的科研與臨床研究,但是由于其早期發(fā)病癥狀不易被發(fā)現(xiàn)并且發(fā)病快,手術(shù)切除率低,復(fù)發(fā)性高等特點(diǎn),胰腺癌已然成為了全世界十大惡性腫瘤之一。正是由于胰腺癌所具有的這些巨大的危害,對于胰腺癌發(fā)病機(jī)制的研究,對于胰腺癌早期發(fā)病診斷的探索,對于胰腺癌藥物作用靶點(diǎn)的尋找,對于治療胰腺癌的特異性藥物,成為了廣大科學(xué)工作者所要面臨的重大挑戰(zhàn)和任務(wù)。胰腺癌以生長迅速并早期發(fā)生轉(zhuǎn)移為特征,其病因及發(fā)病機(jī)理至今不明。隨著腫瘤學(xué)和分子生物學(xué)研究的不斷進(jìn)步,使腫瘤的發(fā)病機(jī)制日益受到人們的重視,成為了全球生物醫(yī)學(xué)工作者研究的熱點(diǎn)。大量的研究表明,胰腺癌細(xì)胞與細(xì)胞周圍微環(huán)境之間的信號傳導(dǎo)途徑,在胰腺癌細(xì)胞的生長,增殖,血管生成,遷移,侵襲和轉(zhuǎn)移中都起著至關(guān)重要的作用。并且在很大程度上,信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是通過所包含的膜蛋白將腫瘤細(xì)胞外的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)從而產(chǎn)生一系列的效應(yīng)。許多的研究報道都發(fā)現(xiàn),G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的信號通路中各個信號分子的的異常性表達(dá)、突變以及失調(diào)都在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有著至關(guān)重要的作用。其中GPCRs是細(xì)胞表面最大的參與信號傳輸?shù)姆肿蛹易?這些受體能夠調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能,在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo),調(diào)控細(xì)胞增殖和遷移以及基因轉(zhuǎn)錄等方面都起著至關(guān)重要的作用。最近研究證實GPCRs已成為腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素,能有效的調(diào)節(jié)血管再生以及新陳代謝。惡性腫瘤細(xì)胞通常會損害GPCRs的正常生理功能,使腫瘤細(xì)胞能夠自主進(jìn)行生存,繁殖,躲避免疫系統(tǒng),增強(qiáng)血液的供應(yīng)以及侵入周圍的正常組織以至于傳播到其他的器官中。GPCRs是原癌基因信號分子的關(guān)鍵調(diào)控蛋白,參與著許多癌癥的發(fā)生和發(fā)展,包括胃癌,大腸癌,前列腺癌,乳腺癌,肺癌,肝癌等多種常見的惡性腫瘤,是當(dāng)前熱門的癌癥治療藥物作用靶點(diǎn)。GPR137是由同源性篩查發(fā)現(xiàn)的,一種新穎的G蛋白偶聯(lián)受體。GPR137基因,位于人的第11號染色體上,并編碼一個包含325個氨基酸的孤兒G蛋白受體。GPR137基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中大量表達(dá),在結(jié)構(gòu)上GPR137基因與前列腺特異氣味型孤兒G蛋白偶聯(lián)受體(PSGR)高度同源。研究表明,PSGR在人類前列腺組織中限制性表達(dá),并且已經(jīng)作為前列腺癌癥的診斷標(biāo)記物。另外,越來越多的研究也證實GPR137基因參與體內(nèi)一些如肝癌、乳腺癌等腫瘤的形成過程。但是該基因在胰腺癌中的生理作用尚未有報道。目的mRNA可以被小干擾RNA (siRNA)特異性的降解,從而目的基因會發(fā)生轉(zhuǎn)錄后沉默,這種生物技術(shù)即為RNA干擾技術(shù)。這種RNA干擾現(xiàn)象在自然界中廣泛的存在,通過這種機(jī)制可以使得在進(jìn)化過程中的生物體形成一種有效的抵御所受到的外來基因的侵害,這樣的抵御外來侵害機(jī)制在生物體進(jìn)化過程中穩(wěn)定基因組免受外來侵害中擔(dān)任了非常重要的角色。RNA干擾技術(shù)能夠敲除和關(guān)閉研究者實驗所需要的特定基因的表達(dá),并具有特異性高、敲除率強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)在近年來被廣泛地應(yīng)用在各個基因功能探索和檢測實驗中,尤其是在惡性腫瘤治療領(lǐng)域。因此在本課題中,我們運(yùn)用RNA干擾技術(shù)特異性的敲除GPR137基因表達(dá),研究其在胰腺癌細(xì)胞中的功能表型變化,并進(jìn)一步探索GPR137引發(fā)胰腺癌可能的分子機(jī)制。首先,我們通過對胰腺癌臨床相關(guān)性研究,分析比較在正常癌旁胰腺組織組織和胰腺癌組織中GPR137的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織內(nèi)GPR137表達(dá)水平均出現(xiàn)上調(diào),接下來為了進(jìn)一步探究GPR137對于胰腺癌發(fā)生發(fā)展的重要性,我們構(gòu)建了GPR137基因的慢病毒敲減和過表達(dá)載體,包裝成病毒顆粒并感染人胰腺癌細(xì)胞系BXPC-3和PANC-1,采用實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和Western印跡法驗證GPR137基因的mRNA和蛋白的表達(dá),確定其抑制效率。隨后,我們檢測了細(xì)胞的增殖遷移的能力,包括噻唑藍(lán)(MTT)比色實驗細(xì)胞,克隆形成等實驗、。同時實驗還運(yùn)用了流式細(xì)胞分析實檢測了胰腺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染GPR137-RNAi慢病毒載體后胰腺癌細(xì)胞的周期分布情況,觀察并分析了敲除GPR137基因后,對惡性胰腺癌細(xì)胞增殖、克隆形成和周期分布的影響。結(jié)果表明,GPR137-RNAi能有效抑制胰腺癌細(xì)胞中GPR137基因的mRNA和蛋白的表達(dá),感染后的胰腺癌細(xì)胞的增殖和克隆形成能力明顯的受到抑制,說明GPR137在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。流式細(xì)胞儀的分析表明敲除胰腺癌細(xì)胞的GPR137基因后,細(xì)胞周期阻滯于亞G1期,并且凋亡細(xì)胞顯著增加。此外,Western印跡法檢測表明GPR137基因的沉默是通過PARP的活化和Caspase-3的上調(diào)來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。綜上所述,GPR137基因在體外對胰腺癌細(xì)胞的增殖、克隆形成具有重要影響,同時,GPR137基因作為潛在的靶向基因,為胰腺癌的治療研究提供了有力的理論依據(jù)和前景展望。第一部分GPR137與胰腺癌的臨床相關(guān)性研究[研究目的]通過對胰腺癌臨床相關(guān)性研究,分析比較在正常癌旁胰腺組織組織和胰腺癌組織中GPR137的表達(dá)情況[研究方法](1) 免疫組織化學(xué)法比較了41例胰腺癌組織和癌旁胰腺組織,GPR137在胰腺癌和癌旁胰腺組織組織中的表達(dá)情況區(qū)別[結(jié)果](1)GPR137在胰腺癌組織和癌旁胰腺組織中的表達(dá)情況。20例呈陽性表達(dá),1例呈弱陽性表達(dá)或無陽性表達(dá)。GPR137在胰腺癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁胰腺組織。[結(jié)論]本部分免疫組化實驗結(jié)果表明了GPR137在胰腺癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁胰腺組織,實驗結(jié)果雖然跟患者的年齡,性別,分期等沒有什么顯著性的差異,這可能由于樣本量少的原因。根據(jù)本實驗結(jié)果中胰腺癌組織內(nèi)GPR137表達(dá)水平均出現(xiàn)上調(diào),可以推斷GPR137在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的重要性。GPR137基因的沉默是通過PARP的活化和Caspase-3的上調(diào)來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。綜上所述,GPR137基因在體外對胰腺癌細(xì)胞的增殖、克隆形成具有重要影響,同時,GPR137基因作為潛在的靶向基因,為胰腺癌的治療研究提供了有力的理論依據(jù)和前景展望。第一部分GPR137與胰腺癌的臨床相關(guān)性研究[研究目的]通過對胰腺癌臨床相關(guān)性研究,分析比較在正常癌旁胰腺組織組織和胰腺癌組織中GPR137的表達(dá)情況[研究方法](1) 免疫組織化學(xué)法比較了41例胰腺癌組織和癌旁胰腺組織,GPR137在胰腺癌和癌旁胰腺組織組織中的表達(dá)情況區(qū)別[結(jié)果](1)GPR137在胰腺癌組織和癌旁胰腺組織中的表達(dá)情況。20例呈陽性表達(dá),1例呈弱陽性表達(dá)或無陽性表達(dá)。GPR137在胰腺癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁胰腺組織。[結(jié)論]本部分免疫組化實驗結(jié)果表明了GPR137在胰腺癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁胰腺組織,實驗結(jié)果雖然跟患者的年齡,性別,分期等沒有什么顯著性的差異,這可能由于樣本量少的原因。根據(jù)本實驗結(jié)果中胰腺癌組織內(nèi)GPR137表達(dá)水平均出現(xiàn)上調(diào),可以推斷GPR137在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的重要性。第二部分GPR137-RNAi慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建和包裝[研究目的]GPR137-RNAi'漫病毒載體的構(gòu)建和包裝,沉默胰腺癌細(xì)胞中GPR137基因的表達(dá),為接下來的GPR137在胰腺癌細(xì)胞中的研究奠定實驗基礎(chǔ)。[研究方法](1)根據(jù)GenBank提供的GPR137的mRNA靶基因序列,設(shè)計并合成4對GPR137特異的siRNA。(2)4組GPR137慢病毒敲減和過表達(dá)載體的構(gòu)建,并分別測序檢測。(3)慢病毒包裝實驗,并通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率和滴度檢測。[結(jié)果](1)根據(jù)設(shè)計原則,成功設(shè)計并合成了4對針對GPR137基因的siRNA。(2)成功地構(gòu)建了4組GPR137慢病毒敲減和過表達(dá)地載體。(3) GPR137-RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染48小時后,在熒光顯微鏡下觀察,可見被病毒感染的細(xì)胞呈綠色熒光,轉(zhuǎn)染效率大于90%,證明轉(zhuǎn)染成功。隨后滴度測定顯示細(xì)胞感染效率接近100%。[結(jié)論]本實驗根據(jù)網(wǎng)上在線設(shè)計siRNA的軟件,遵循RNAi設(shè)計原則,最終以慢病毒為載體構(gòu)建了4條針對GPR137基因的干擾片段,并通過熒光檢測其轉(zhuǎn)染效率大于90%,滴度檢測為為1.0E+07 TU/ml,成功構(gòu)建了針對目的基因GPR137的慢病毒載體,為下一步GPR137基因的研究提供了實驗基礎(chǔ)。(1)根據(jù)設(shè)計原則,成功設(shè)計并合成了4對針對GPR137基因的siRNA。(2)成功地構(gòu)建了4組GPR137慢病毒敲減和過表達(dá)地載體。(3) GPR137-RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染48小時后,在熒光顯微鏡下觀察,可見被病毒感染的細(xì)胞呈綠色熒光,轉(zhuǎn)染效率大于90%,證明轉(zhuǎn)染成功。隨后滴度測定顯示細(xì)胞感染效率接近100%。[結(jié)論]本實驗根據(jù)網(wǎng)上在線設(shè)計siRNA的軟件,遵循RNAi設(shè)計原則,最終以慢病毒為載體構(gòu)建了4條針對GPR137基因的干擾片段,并通過熒光檢測其轉(zhuǎn)染效率大于90%,滴度檢測為為1.0E+07 TU/ml,成功構(gòu)建了針對目的基因GPR137的慢病毒載體,為下一步GPR137基因的研究提供了實驗基礎(chǔ)。第三部分GPR137在胰腺癌細(xì)胞中的功能表型研究[研究目的]通過各種功能檢測實驗,檢測敲除GPR137后胰腺癌細(xì)胞功能表型的變化,確定GPR137與胰腺癌發(fā)生發(fā)展的重要性。[研究方法](1)慢病毒感染實驗,熒光觀察GPR137-RNAi慢病毒載體的感染效率。(2)運(yùn)用qRT-PCR方法檢測GPR137-RNAi慢病毒載體在mRNA層面上對GPR137基因的敲減效率。(3)運(yùn)用MTT細(xì)胞增殖實驗檢測了敲除GPR137后胰腺癌細(xì)胞增殖情況的變化。(4)運(yùn)用克隆形成實驗檢測了敲除GPR137后胰腺癌細(xì)胞克隆形成能力的變化。(5)運(yùn)用流式細(xì)胞儀方法檢測了敲除GPR137后胰腺癌細(xì)胞周期的變化情況。(6)運(yùn)用Annexin V和7-AAD對聯(lián)合染色檢測Lv-shGPR137對細(xì)胞凋亡情況的影響。[結(jié)果](1)用構(gòu)建好的慢病毒表達(dá)載體Lv-shCon和Lv-shGPR137去感染兩株人胰腺癌細(xì)胞BXPC-3及PANC-1,熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),在BXPC-3中,慢病毒表達(dá)載體Lv-shCon和Lv-shGPR137的感染效率很高,達(dá)到90%以上；在PANC-1中,所構(gòu)建的慢病毒表達(dá)載體依然有很高的感染效率,約為80%左右。(2) BXPC-3和PANC-1細(xì)胞在感染Lv-shGPR137 48h后提RNA進(jìn)行qRT-PCR檢測,GPR137敲減組比對照組的mRNA水平均降低了將近80%。(3)在BXPC-3、PANC-1中進(jìn)行MTT細(xì)胞增殖實驗,Lv-shGPR137幾乎完全抑制了胰腺癌細(xì)胞的生長。(4) BXPC-3細(xì)胞感染Lv-shGPR137后稀釋成單個細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),觀察發(fā)現(xiàn)Lv-shGPR137可以明顯抑制BXPC-3細(xì)胞的克隆形成能力。(5)用BXPC-3細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期實驗,BXPC-3細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)生了明顯的變化,其處于G0/G1的細(xì)胞下降到細(xì)胞總數(shù)的50%左右,而處在S期的細(xì)胞數(shù)量則明顯上升,達(dá)到了35%,三組細(xì)胞處于G2/M期的細(xì)胞數(shù)量差異不大。(6) BXPC-3細(xì)胞在感染了Lv-shGPR137后,其活細(xì)胞數(shù)量明顯減少,約占總數(shù)的8%,處于早期凋亡的的細(xì)胞數(shù)量上升不明顯,大約為細(xì)胞總數(shù)的17%,而晚期凋亡的細(xì)胞數(shù)量則急劇增多,接近70%。[結(jié)論]成功構(gòu)建了GPR137-RNAi的慢病毒載體并轉(zhuǎn)染入胰腺癌細(xì)胞中,通過沉默胰腺癌細(xì)胞中的GPR137基因的表達(dá),探究GPR137缺失前后胰腺癌細(xì)胞功能表型的變化,結(jié)果表明GPR137在胰腺癌細(xì)胞中能明顯抑制細(xì)胞的增殖和遷移,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。(3)在BXPC-3、PANC-1中進(jìn)行MTT細(xì)胞增殖實驗,Lv-shGPR137幾乎完全抑制了胰腺癌細(xì)胞的生長。(4) BXPC-3細(xì)胞感染Lv-shGPR137后稀釋成單個細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),觀察發(fā)現(xiàn)Lv-shGPR137可以明顯抑制BXPC-3細(xì)胞的克隆形成能力。(5)用BXPC-3細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期實驗,BXPC-3細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)生了明顯的變化,其處于G0/G1的細(xì)胞下降到細(xì)胞總數(shù)的50%左右,而處在S期的細(xì)胞數(shù)量則明顯上升,達(dá)到了35%,三組細(xì)胞處于G2/M期的細(xì)胞數(shù)量差異不大。(6) BXPC-3細(xì)胞在感染了Lv-shGPR137后,其活細(xì)胞數(shù)量明顯減少,約占總數(shù)的8%,處于早期凋亡的的細(xì)胞數(shù)量上升不明顯,大約為細(xì)胞總數(shù)的17%,而晚期凋亡的細(xì)胞數(shù)量則急劇增多,接近70%。[結(jié)論]成功構(gòu)建了GPR137-RNAi的慢病毒載體并轉(zhuǎn)染入胰腺癌細(xì)胞中,通過沉默胰腺癌細(xì)胞中的GPR137基因的表達(dá),探究GPR137缺失前后胰腺癌細(xì)胞功能表型的變化,結(jié)果表明GPR137在胰腺癌細(xì)胞中能明顯抑制細(xì)胞的增殖和遷移,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。第四部分 GPR137在胰腺癌細(xì)胞中的分子機(jī)制研究[研究目的]對可能調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的增殖抑制及促凋亡的分子機(jī)制和關(guān)鍵的蛋白的研究。[研究方法]運(yùn)用Western Blot技術(shù)檢測抑制GPR137對胰腺癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況改變[結(jié)果]在敲除GPR137的胰腺癌細(xì)胞中,PARP蛋白發(fā)生了活化,Caspase-3蛋白發(fā)生了上調(diào),提示PARP和Caspase-3在抑制GPR137誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了重要的作用。[結(jié)論]在胰腺癌細(xì)胞中,抑制GPR137的表達(dá)后,PARP發(fā)生了明顯的裂解激活現(xiàn)象,而Caspase-3的表達(dá)也明顯增強(qiáng),說明了胰腺癌細(xì)胞發(fā)生了明顯凋亡,并且可能是由于PARP的裂解激活和Caspase-3的上調(diào)所導(dǎo)致的。本實驗對GPR137基因在胰腺癌中抑制細(xì)胞增殖和遷移、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制做了初步的探討,為尋找胰腺癌新的診斷標(biāo)志物和藥物作用靶標(biāo)提供了理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：GPR137 胰腺癌 癌旁胰腺組織 慢病毒載體 過表達(dá)載體 siRNA 滴度測定 MTT 克隆形成 流式細(xì)胞儀 PARP Caspase-3 細(xì)胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.9
【目錄】：

• 中文摘要8-14
• 英文摘要14-19
• 符號說明19-20
• 前言20-31
• 附圖表29-31
• 第一部分：GPR137與胰腺癌的臨床相關(guān)性研究31-38
• 一、前言31
• 二、實驗材料31-33
• 三、實驗方法33-35
• 四、實驗結(jié)果35
• 五、討論35-37
• 六、附圖表37-38
• 第二部分 GPR137-RNAI慢病毒載體構(gòu)建和包裝38-59
• 一、前言38
• 二、實驗材料38-40
• 三、實驗方法40-45
• 四、實驗結(jié)果45-49
• 五、討論49-50
• 六、附圖表50-59
• 第三部分 細(xì)胞水平功能驗證59-80
• 一、前言59
• 二、實驗材料59-61
• 三、實驗方法61-67
• 四、實驗結(jié)果67-69
• 五、討論69-70
• 六、附圖表70-80
• 第四部分 研究GPR137基因在胰腺癌中抑制細(xì)胞增殖和遷移、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制80-88
• 一、前言80-81
• 二、實驗材料81-83
• 三、實驗方法83-84
• 四、實驗結(jié)果84-85
• 五、討論85-86
• 六、結(jié)論86-87
• 七、附圖表87-88
• 參考文獻(xiàn)88-95
• 致謝95-96
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄96-97
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況97-98
• 外文論文Ⅰ98-116
• 外文論文Ⅱ116-125

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中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 崔現(xiàn)平;GPR137對胰腺癌生長侵襲轉(zhuǎn)移性影響及其調(diào)控機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2015年

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本文編號：721751