本文關(guān)鍵詞：GPR137對胰腺癌生長侵襲轉(zhuǎn)移性影響及其調(diào)控機制研究

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【摘要】：胰腺癌是一種常見的消化道惡性腫瘤。近年來胰腺癌的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)明顯的上升趨勢,其惡性程度高,侵襲能力強,是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計,在經(jīng)濟發(fā)達地區(qū)以及工業(yè)化程度偏高的地區(qū),胰腺癌的發(fā)病率明顯偏高,美國胰腺癌的致死率位于惡性腫瘤中的第四位。在中國,隨著經(jīng)濟的飛速發(fā)展,環(huán)境的不斷惡化以及人們生活方式的改變,胰腺癌的發(fā)病率也呈現(xiàn)逐年上升趨勢。雖然已經(jīng)存在大量與胰腺癌相關(guān)的科研與臨床研究,但是由于其早期發(fā)病癥狀不易被發(fā)現(xiàn)并且發(fā)病快,手術(shù)切除率低,復(fù)發(fā)性高等特點,胰腺癌已然成為了全世界十大惡性腫瘤之一。正是由于胰腺癌所具有的這些巨大的危害,對于胰腺癌發(fā)病機制的研究,對于胰腺癌早期發(fā)病診斷的探索,對于胰腺癌藥物作用靶點的尋找,對于治療胰腺癌的特異性藥物,成為了廣大科學(xué)工作者所要面臨的重大挑戰(zhàn)和任務(wù)。胰腺癌以生長迅速并早期發(fā)生轉(zhuǎn)移為特征,其病因及發(fā)病機理至今不明。隨著腫瘤學(xué)和分子生物學(xué)研究的不斷進步,使腫瘤的發(fā)病機制日益受到人們的重視,成為了全球生物醫(yī)學(xué)工作者研究的熱點。大量的研究表明,胰腺癌細胞與細胞周圍微環(huán)境之間的信號傳導(dǎo)途徑,在胰腺癌細胞的生長,增殖,血管生成,遷移,侵襲和轉(zhuǎn)移中都起著至關(guān)重要的作用。并且在很大程度上,信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是通過所包含的膜蛋白將腫瘤細胞外的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)入細胞內(nèi)從而產(chǎn)生一系列的效應(yīng)。許多的研究報道都發(fā)現(xiàn),G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的信號通路中各個信號分子的的異常性表達、突變以及失調(diào)都在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有著至關(guān)重要的作用。其中GPCRs是細胞表面最大的參與信號傳輸?shù)姆肿蛹易?這些受體能夠調(diào)節(jié)多種細胞功能,在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo),調(diào)控細胞增殖和遷移以及基因轉(zhuǎn)錄等方面都起著至關(guān)重要的作用。最近研究證實GPCRs已成為腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素,能有效的調(diào)節(jié)血管再生以及新陳代謝。惡性腫瘤細胞通常會損害GPCRs的正常生理功能,使腫瘤細胞能夠自主進行生存,繁殖,躲避免疫系統(tǒng),增強血液的供應(yīng)以及侵入周圍的正常組織以至于傳播到其他的器官中。GPCRs是原癌基因信號分子的關(guān)鍵調(diào)控蛋白,參與著許多癌癥的發(fā)生和發(fā)展,包括胃癌,大腸癌,前列腺癌,乳腺癌,肺癌,肝癌等多種常見的惡性腫瘤,是當(dāng)前熱門的癌癥治療藥物作用靶點。GPR137是由同源性篩查發(fā)現(xiàn)的,一種新穎的G蛋白偶聯(lián)受體。GPR137基因,位于人的第11號染色體上,并編碼一個包含325個氨基酸的孤兒G蛋白受體。GPR137基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中大量表達,在結(jié)構(gòu)上GPR137基因與前列腺特異氣味型孤兒G蛋白偶聯(lián)受體(PSGR)高度同源。研究表明,PSGR在人類前列腺組織中限制性表達,并且已經(jīng)作為前列腺癌癥的診斷標(biāo)記物。另外,越來越多的研究也證實GPR137基因參與體內(nèi)一些如肝癌、乳腺癌等腫瘤的形成過程。但是該基因在胰腺癌中的生理作用尚未有報道。目的mRNA可以被小干擾RNA (siRNA)特異性的降解,從而目的基因會發(fā)生轉(zhuǎn)錄后沉默,這種生物技術(shù)即為RNA干擾技術(shù)。這種RNA干擾現(xiàn)象在自然界中廣泛的存在,通過這種機制可以使得在進化過程中的生物體形成一種有效的抵御所受到的外來基因的侵害,這樣的抵御外來侵害機制在生物體進化過程中穩(wěn)定基因組免受外來侵害中擔(dān)任了非常重要的角色。RNA干擾技術(shù)能夠敲除和關(guān)閉研究者實驗所需要的特定基因的表達,并具有特異性高、敲除率強等優(yōu)點在近年來被廣泛地應(yīng)用在各個基因功能探索和檢測實驗中,尤其是在惡性腫瘤治療領(lǐng)域。因此在本課題中,我們運用RNA干擾技術(shù)特異性的敲除GPR137基因表達,研究其在胰腺癌細胞中的功能表型變化,并進一步探索GPR137引發(fā)胰腺癌可能的分子機制。首先,我們通過對胰腺癌臨床相關(guān)性研究,分析比較在正常癌旁胰腺組織組織和胰腺癌組織中GPR137的表達情況,發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織內(nèi)GPR137表達水平均出現(xiàn)上調(diào),接下來為了進一步探究GPR137對于胰腺癌發(fā)生發(fā)展的重要性,我們構(gòu)建了GPR137基因的慢病毒敲減和過表達載體,包裝成病毒顆粒并感染人胰腺癌細胞系BXPC-3和PANC-1,采用實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和Western印跡法驗證GPR137基因的mRNA和蛋白的表達,確定其抑制效率。隨后,我們檢測了細胞的增殖遷移的能力,包括噻唑藍(MTT)比色實驗細胞,克隆形成等實驗、。同時實驗還運用了流式細胞分析實檢測了胰腺癌細胞中轉(zhuǎn)染GPR137-RNAi慢病毒載體后胰腺癌細胞的周期分布情況,觀察并分析了敲除GPR137基因后,對惡性胰腺癌細胞增殖、克隆形成和周期分布的影響。結(jié)果表明,GPR137-RNAi能有效抑制胰腺癌細胞中GPR137基因的mRNA和蛋白的表達,感染后的胰腺癌細胞的增殖和克隆形成能力明顯的受到抑制,說明GPR137在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。流式細胞儀的分析表明敲除胰腺癌細胞的GPR137基因后,細胞周期阻滯于亞G1期,并且凋亡細胞顯著增加。此外,Western印跡法檢測表明GPR137基因的沉默是通過PARP的活化和Caspase-3的上調(diào)來誘導(dǎo)細胞凋亡。綜上所述,GPR137基因在體外對胰腺癌細胞的增殖、克隆形成具有重要影響,同時,GPR137基因作為潛在的靶向基因,為胰腺癌的治療研究提供了有力的理論依據(jù)和前景展望。第一部分GPR137與胰腺癌的臨床相關(guān)性研究[研究目的]通過對胰腺癌臨床相關(guān)性研究,分析比較在正常癌旁胰腺組織組織和胰腺癌組織中GPR137的表達情況[研究方法](1) 免疫組織化學(xué)法比較了41例胰腺癌組織和癌旁胰腺組織,GPR137在胰腺癌和癌旁胰腺組織組織中的表達情況區(qū)別[結(jié)果](1)GPR137在胰腺癌組織和癌旁胰腺組織中的表達情況。20例呈陽性表達,1例呈弱陽性表達或無陽性表達。GPR137在胰腺癌組織中的表達顯著高于癌旁胰腺組織。[結(jié)論]本部分免疫組化實驗結(jié)果表明了GPR137在胰腺癌組織中的表達顯著高于癌旁胰腺組織,實驗結(jié)果雖然跟患者的年齡,性別,分期等沒有什么顯著性的差異,這可能由于樣本量少的原因。根據(jù)本實驗結(jié)果中胰腺癌組織內(nèi)GPR137表達水平均出現(xiàn)上調(diào),可以推斷GPR137在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的重要性。GPR137基因的沉默是通過PARP的活化和Caspase-3的上調(diào)來誘導(dǎo)細胞凋亡。綜上所述,GPR137基因在體外對胰腺癌細胞的增殖、克隆形成具有重要影響,同時,GPR137基因作為潛在的靶向基因,為胰腺癌的治療研究提供了有力的理論依據(jù)和前景展望。第一部分GPR137與胰腺癌的臨床相關(guān)性研究[研究目的]通過對胰腺癌臨床相關(guān)性研究,分析比較在正常癌旁胰腺組織組織和胰腺癌組織中GPR137的表達情況[研究方法](1) 免疫組織化學(xué)法比較了41例胰腺癌組織和癌旁胰腺組織,GPR137在胰腺癌和癌旁胰腺組織組織中的表達情況區(qū)別[結(jié)果](1)GPR137在胰腺癌組織和癌旁胰腺組織中的表達情況。20例呈陽性表達,1例呈弱陽性表達或無陽性表達。GPR137在胰腺癌組織中的表達顯著高于癌旁胰腺組織。[結(jié)論]本部分免疫組化實驗結(jié)果表明了GPR137在胰腺癌組織中的表達顯著高于癌旁胰腺組織,實驗結(jié)果雖然跟患者的年齡,性別,分期等沒有什么顯著性的差異,這可能由于樣本量少的原因。根據(jù)本實驗結(jié)果中胰腺癌組織內(nèi)GPR137表達水平均出現(xiàn)上調(diào),可以推斷GPR137在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的重要性。第二部分GPR137-RNAi慢病毒表達載體構(gòu)建和包裝[研究目的]GPR137-RNAi'漫病毒載體的構(gòu)建和包裝,沉默胰腺癌細胞中GPR137基因的表達,為接下來的GPR137在胰腺癌細胞中的研究奠定實驗基礎(chǔ)。[研究方法](1)根據(jù)GenBank提供的GPR137的mRNA靶基因序列,設(shè)計并合成4對GPR137特異的siRNA。(2)4組GPR137慢病毒敲減和過表達載體的構(gòu)建,并分別測序檢測。(3)慢病毒包裝實驗,并通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率和滴度檢測。[結(jié)果](1)根據(jù)設(shè)計原則,成功設(shè)計并合成了4對針對GPR137基因的siRNA。(2)成功地構(gòu)建了4組GPR137慢病毒敲減和過表達地載體。(3) GPR137-RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染48小時后,在熒光顯微鏡下觀察,可見被病毒感染的細胞呈綠色熒光,轉(zhuǎn)染效率大于90%,證明轉(zhuǎn)染成功。隨后滴度測定顯示細胞感染效率接近100%。[結(jié)論]本實驗根據(jù)網(wǎng)上在線設(shè)計siRNA的軟件,遵循RNAi設(shè)計原則,最終以慢病毒為載體構(gòu)建了4條針對GPR137基因的干擾片段,并通過熒光檢測其轉(zhuǎn)染效率大于90%,滴度檢測為為1.0E+07 TU/ml,成功構(gòu)建了針對目的基因GPR137的慢病毒載體,為下一步GPR137基因的研究提供了實驗基礎(chǔ)。(1)根據(jù)設(shè)計原則,成功設(shè)計并合成了4對針對GPR137基因的siRNA。(2)成功地構(gòu)建了4組GPR137慢病毒敲減和過表達地載體。(3) GPR137-RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染48小時后,在熒光顯微鏡下觀察,可見被病毒感染的細胞呈綠色熒光,轉(zhuǎn)染效率大于90%,證明轉(zhuǎn)染成功。隨后滴度測定顯示細胞感染效率接近100%。[結(jié)論]本實驗根據(jù)網(wǎng)上在線設(shè)計siRNA的軟件,遵循RNAi設(shè)計原則,最終以慢病毒為載體構(gòu)建了4條針對GPR137基因的干擾片段,并通過熒光檢測其轉(zhuǎn)染效率大于90%,滴度檢測為為1.0E+07 TU/ml,成功構(gòu)建了針對目的基因GPR137的慢病毒載體,為下一步GPR137基因的研究提供了實驗基礎(chǔ)。第三部分GPR137在胰腺癌細胞中的功能表型研究[研究目的]通過各種功能檢測實驗,檢測敲除GPR137后胰腺癌細胞功能表型的變化,確定GPR137與胰腺癌發(fā)生發(fā)展的重要性。[研究方法](1)慢病毒感染實驗,熒光觀察GPR137-RNAi慢病毒載體的感染效率。(2)運用qRT-PCR方法檢測GPR137-RNAi慢病毒載體在mRNA層面上對GPR137基因的敲減效率。(3)運用MTT細胞增殖實驗檢測了敲除GPR137后胰腺癌細胞增殖情況的變化。(4)運用克隆形成實驗檢測了敲除GPR137后胰腺癌細胞克隆形成能力的變化。(5)運用流式細胞儀方法檢測了敲除GPR137后胰腺癌細胞周期的變化情況。(6)運用Annexin V和7-AAD對聯(lián)合染色檢測Lv-shGPR137對細胞凋亡情況的影響。[結(jié)果](1)用構(gòu)建好的慢病毒表達載體Lv-shCon和Lv-shGPR137去感染兩株人胰腺癌細胞BXPC-3及PANC-1,熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),在BXPC-3中,慢病毒表達載體Lv-shCon和Lv-shGPR137的感染效率很高,達到90%以上；在PANC-1中,所構(gòu)建的慢病毒表達載體依然有很高的感染效率,約為80%左右。(2) BXPC-3和PANC-1細胞在感染Lv-shGPR137 48h后提RNA進行qRT-PCR檢測,GPR137敲減組比對照組的mRNA水平均降低了將近80%。(3)在BXPC-3、PANC-1中進行MTT細胞增殖實驗,Lv-shGPR137幾乎完全抑制了胰腺癌細胞的生長。(4) BXPC-3細胞感染Lv-shGPR137后稀釋成單個細胞進行培養(yǎng),觀察發(fā)現(xiàn)Lv-shGPR137可以明顯抑制BXPC-3細胞的克隆形成能力。(5)用BXPC-3細胞進行細胞周期實驗,BXPC-3細胞的細胞周期發(fā)生了明顯的變化,其處于G0/G1的細胞下降到細胞總數(shù)的50%左右,而處在S期的細胞數(shù)量則明顯上升,達到了35%,三組細胞處于G2/M期的細胞數(shù)量差異不大。(6) BXPC-3細胞在感染了Lv-shGPR137后,其活細胞數(shù)量明顯減少,約占總數(shù)的8%,處于早期凋亡的的細胞數(shù)量上升不明顯,大約為細胞總數(shù)的17%,而晚期凋亡的細胞數(shù)量則急劇增多,接近70%。[結(jié)論]成功構(gòu)建了GPR137-RNAi的慢病毒載體并轉(zhuǎn)染入胰腺癌細胞中,通過沉默胰腺癌細胞中的GPR137基因的表達,探究GPR137缺失前后胰腺癌細胞功能表型的變化,結(jié)果表明GPR137在胰腺癌細胞中能明顯抑制細胞的增殖和遷移,促進細胞的凋亡。(3)在BXPC-3、PANC-1中進行MTT細胞增殖實驗,Lv-shGPR137幾乎完全抑制了胰腺癌細胞的生長。(4) BXPC-3細胞感染Lv-shGPR137后稀釋成單個細胞進行培養(yǎng),觀察發(fā)現(xiàn)Lv-shGPR137可以明顯抑制BXPC-3細胞的克隆形成能力。(5)用BXPC-3細胞進行細胞周期實驗,BXPC-3細胞的細胞周期發(fā)生了明顯的變化,其處于G0/G1的細胞下降到細胞總數(shù)的50%左右,而處在S期的細胞數(shù)量則明顯上升,達到了35%,三組細胞處于G2/M期的細胞數(shù)量差異不大。(6) BXPC-3細胞在感染了Lv-shGPR137后,其活細胞數(shù)量明顯減少,約占總數(shù)的8%,處于早期凋亡的的細胞數(shù)量上升不明顯,大約為細胞總數(shù)的17%,而晚期凋亡的細胞數(shù)量則急劇增多,接近70%。[結(jié)論]成功構(gòu)建了GPR137-RNAi的慢病毒載體并轉(zhuǎn)染入胰腺癌細胞中,通過沉默胰腺癌細胞中的GPR137基因的表達,探究GPR137缺失前后胰腺癌細胞功能表型的變化,結(jié)果表明GPR137在胰腺癌細胞中能明顯抑制細胞的增殖和遷移,促進細胞的凋亡。第四部分 GPR137在胰腺癌細胞中的分子機制研究[研究目的]對可能調(diào)控胰腺癌細胞的增殖抑制及促凋亡的分子機制和關(guān)鍵的蛋白的研究。[研究方法]運用Western Blot技術(shù)檢測抑制GPR137對胰腺癌細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達情況改變[結(jié)果]在敲除GPR137的胰腺癌細胞中,PARP蛋白發(fā)生了活化,Caspase-3蛋白發(fā)生了上調(diào),提示PARP和Caspase-3在抑制GPR137誘導(dǎo)胰腺癌細胞凋亡中發(fā)揮了重要的作用。[結(jié)論]在胰腺癌細胞中,抑制GPR137的表達后,PARP發(fā)生了明顯的裂解激活現(xiàn)象,而Caspase-3的表達也明顯增強,說明了胰腺癌細胞發(fā)生了明顯凋亡,并且可能是由于PARP的裂解激活和Caspase-3的上調(diào)所導(dǎo)致的。本實驗對GPR137基因在胰腺癌中抑制細胞增殖和遷移、促進細胞凋亡的分子機制做了初步的探討,為尋找胰腺癌新的診斷標(biāo)志物和藥物作用靶標(biāo)提供了理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：GPR137 胰腺癌 癌旁胰腺組織 慢病毒載體 過表達載體 siRNA 滴度測定 MTT 克隆形成 流式細胞儀 PARP Caspase-3 細胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.9
【目錄】：

• 中文摘要8-14
• 英文摘要14-19
• 符號說明19-20
• 前言20-31
• 附圖表29-31
• 第一部分：GPR137與胰腺癌的臨床相關(guān)性研究31-38
• 一、前言31
• 二、實驗材料31-33
• 三、實驗方法33-35
• 四、實驗結(jié)果35
• 五、討論35-37
• 六、附圖表37-38
• 第二部分 GPR137-RNAI慢病毒載體構(gòu)建和包裝38-59
• 一、前言38
• 二、實驗材料38-40
• 三、實驗方法40-45
• 四、實驗結(jié)果45-49
• 五、討論49-50
• 六、附圖表50-59
• 第三部分 細胞水平功能驗證59-80
• 一、前言59
• 二、實驗材料59-61
• 三、實驗方法61-67
• 四、實驗結(jié)果67-69
• 五、討論69-70
• 六、附圖表70-80
• 第四部分 研究GPR137基因在胰腺癌中抑制細胞增殖和遷移、促進細胞凋亡的分子機制80-88
• 一、前言80-81
• 二、實驗材料81-83
• 三、實驗方法83-84
• 四、實驗結(jié)果84-85
• 五、討論85-86
• 六、結(jié)論86-87
• 七、附圖表87-88
• 參考文獻88-95
• 致謝95-96
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄96-97
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況97-98
• 外文論文Ⅰ98-116
• 外文論文Ⅱ116-125

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中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 崔現(xiàn)平;GPR137對胰腺癌生長侵襲轉(zhuǎn)移性影響及其調(diào)控機制研究[D];山東大學(xué);2015年

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本文編號：721751