本文關(guān)鍵詞：瘦素信號通路及脂聯(lián)素信號通路與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)研究

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【摘要】：研究背景與研究目的：調(diào)查數(shù)據(jù)顯示,糖尿病的發(fā)病率和患者數(shù)量在世界范圍內(nèi)迅速上升,估計(jì)到2030年全球糖尿病患者將接近5億,其中2型糖尿病是最主要和增長最快的糖尿病類型,占整個(gè)糖尿病人群的90%以上,我國已成為世界上糖尿病患病數(shù)最多的國家,2型糖尿病也已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一,給社會(huì)、經(jīng)濟(jì)以及人們的健康帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。但由于病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,使得對2型糖尿病的預(yù)防和治療存在較大困難。目前,2型糖尿病的病因?qū)W研究認(rèn)為,2型糖尿病是遺傳因素和環(huán)境因素共同參與和相互作用導(dǎo)致的復(fù)雜疾病。這些因素通過大多未知的機(jī)制導(dǎo)致骨骼肌、脂肪和肝臟的胰島素抵抗和(或)β細(xì)胞功能障礙,然后胰島素抵抗合并胰島素分泌不足造成餐后和空腹血糖升高,最終形成糖尿病。而高血糖和相關(guān)的代謝異常又進(jìn)一步改變信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá),即糖脂毒性,形成惡性循環(huán)�；疾÷实纳仙倘慌c過量飲食、運(yùn)動(dòng)量減少等因素有關(guān),而遺傳因素是不容忽視的重要內(nèi)因。以往大量研究證據(jù)已表明2型糖尿病是遺傳性疾病,這些證據(jù)包括：同卵雙胞胎間2型糖尿病發(fā)病的高一致性,2型糖尿病的家族聚集性,以及不同種族間2型糖尿病發(fā)病率的巨大差異。近年來國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的遺傳流行病學(xué)研究,希望找到2型糖尿病的易感基因,以更好地理解其遺傳學(xué)基礎(chǔ)和發(fā)病機(jī)制。截至目前,主要有以下幾種遺傳流行病學(xué)的研究策略和方法用于2型糖尿病易感基因的定位和識別：(1)連鎖分析：連鎖分析是較早用于定位2型糖尿病易感基因的方法。目前,已在20多個(gè)種族人群(如芬蘭人、墨西哥裔美國人、美國白人、英國人、日本人、法國人、中國北方和南方漢族人等)中進(jìn)行全基因組掃描及微衛(wèi)星標(biāo)記與2型糖尿病的連鎖分析,結(jié)果顯示2型糖尿病的易感位點(diǎn)位于多條染色體上,并且在多個(gè)人群中得到驗(yàn)證。(2)候選基因關(guān)聯(lián)研究：候選基因關(guān)聯(lián)研究是根據(jù)某些間接線索(如連鎖分析的結(jié)果或者基因表達(dá)產(chǎn)物的功能信息等)選定一個(gè)或幾個(gè)候選基因,借助于直接測序或等位基因特異性擴(kuò)增等實(shí)驗(yàn)方法,通過在病例和對照中比較候選基因序列差異,來確定這些候選基因與患病狀態(tài)或數(shù)量性狀間是否存在關(guān)聯(lián)。自20多年前第一篇胰島素基因與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)研究發(fā)表以來,與胰腺發(fā)育的分子機(jī)制、胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和胰島素分泌等有關(guān)的2型糖尿病的候選基因明顯增多,但小型的候選基因關(guān)聯(lián)研究的結(jié)果可重復(fù)性較差,僅PPARG和KCNJ11得到較好的重復(fù)。(3)全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome-wide association study, GWAS):它以人類基因組中數(shù)以百萬計(jì)的SNP為標(biāo)記進(jìn)行病例-對照關(guān)聯(lián)分析,以期發(fā)現(xiàn)與復(fù)雜疾病相關(guān)的遺傳變異。自2007年Sladek等在Nature上發(fā)表第一篇關(guān)于2型糖尿病的全基因組關(guān)聯(lián)分析以來,在不同種族、不同人群中開展的2型糖尿病全基因組關(guān)聯(lián)分析有30余項(xiàng),報(bào)道的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)139個(gè),被不同研究驗(yàn)證的60多個(gè)。這些發(fā)現(xiàn)為了解2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制提供了更多的線索,但是它們還是不能全面系統(tǒng)地闡釋2型糖尿病的遺傳機(jī)制,存在著嚴(yán)重的“遺失遺傳度”現(xiàn)象。這可能與全基因組關(guān)聯(lián)分析的局限性有關(guān)。針對這種情況,一些新的策略和方法已經(jīng)被嘗試應(yīng)用到GWAS的后續(xù)研究中,如基因-基因交互作用研究、基于通路的關(guān)聯(lián)分析等。(4)基因-基因交互作用研究：基因-基因交互作用主要指非等位基因間的相互作用,有的文獻(xiàn)中也稱上位效應(yīng),它可能是導(dǎo)致復(fù)雜疾病的主要因素之一。復(fù)雜疾病大多受到微效基因的影響,這些影響更可能通過交互作用分析被檢測出來�；�-基因交互作用研究不僅可以提高發(fā)現(xiàn)基因與疾病關(guān)聯(lián)的功效,而且有助于我們對與疾病相關(guān)生物學(xué)通路的理解。已發(fā)現(xiàn)UCP2和PPARy基因中的兩位點(diǎn)互作與2型糖尿病關(guān)聯(lián),與肥胖相關(guān)候選基因的SNP-SNP互作也可以增加患2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)。(5)基于通路的關(guān)聯(lián)分析：通路分析是近年來發(fā)展的基于先驗(yàn)知識的下游功能學(xué)分析方法,它以已有的先驗(yàn)通路(如KEGG、Biocarta和Gene Ontology等數(shù)據(jù)庫中的通路)中的基因集為分析單元,在基因集水平上尋找疾病關(guān)聯(lián)的通路及生物學(xué)功能,評估通路對疾病風(fēng)險(xiǎn)的貢獻(xiàn)。以功能相關(guān)的基因集為分析單元符合復(fù)雜疾病的多基因遺傳特性,一方面可以起到降維的目的,減少多重比較的次數(shù),增加了檢驗(yàn)效能,另一方面考慮了同一功能基因集中基因間的相互作用,并把復(fù)雜的基因互作看作一個(gè)整體納入分析,能更好地識別互作效應(yīng)和挖掘出具備功能學(xué)意義的互作基因,所得結(jié)果也更具有生物學(xué)解釋能力。在前期研究工作中,我們發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞因子信號通路可能是與2型糖尿病關(guān)聯(lián)較密切的一條通路。脂肪細(xì)胞因子信號通路包含3條子通路,其中瘦素(leptin, LEP)信號通路和脂聯(lián)素(adiponectin, ADIPO)信號通路一直是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。因此,本研究擬選取LEP信號通路和ADIPO信號通路進(jìn)行深入探討,分析基因中單個(gè)SNP與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)、同一基因多個(gè)SNP的連鎖不平衡和LD block內(nèi)的單倍型、SNP-SNP的交互作用以及在通路水平上SNP集與2型糖尿病的關(guān)聯(lián),以期發(fā)現(xiàn)新的有意義的SNP位點(diǎn)、SNP對子和SNP組合,為進(jìn)一步研究2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制和尋找可能的藥物作用靶點(diǎn)提供線索,為個(gè)體2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測及早期干預(yù)提供依據(jù)。材料與方法：本研究采用病例對照設(shè)計(jì),病例為確診的2型糖尿病患者,來自廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院、茂名市人民醫(yī)院、韶關(guān)市人民醫(yī)院、東莞市石龍博愛醫(yī)院、東莞厚街人民醫(yī)院、深圳龍華人民醫(yī)院、深圳市南山人民醫(yī)院、深圳市觀瀾人民醫(yī)院、深圳市西鄉(xiāng)人民醫(yī)院、深圳市福田人民醫(yī)院等10所醫(yī)院的內(nèi)分泌科。對照為與病例同時(shí)期在同一家醫(yī)院體檢的健康人群。按照所在地區(qū)和性別將病例組和對照組受試者進(jìn)行匹配。由統(tǒng)一培訓(xùn)的調(diào)查員對符合納入標(biāo)準(zhǔn)的研究對象進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的問卷調(diào)查,內(nèi)容包括年齡、性別、籍貫、職業(yè)、疾病史、病程、吸煙史、家族史、并發(fā)癥、飲食及運(yùn)動(dòng)情況等。采取受試者外周血,一部分用于生化檢測,一部分冷藏用于提取DNA。提取DNA后,用SNPscanTM多重SNP分型試劑盒對選擇的48個(gè)SNP——LEP通路中15個(gè)基因(LEP、LEPR、JAK1、JAK2、STAT3、SHP-2、 PPARGC1A、PRKAA1、PRKAA2、PRKAB2、 PRKAG1、PRKAG2、PRKAG3、 alpha-MSH、NPY) 的 23 個(gè) SNP(rs4731426、rs2167270、rs12405556、rs17127107、 rs 10889502、rs7849191、rs9891119、rs4767860、rs2970847、rs6821591、rs249429、 rs3805486. rs1342382、rs6588640、rs6937、rs3766522、rs10783299、rs5017427、 rs9648724、rs645163、rs6436094、rs6713532、rs16147)和ADIPO通路中14個(gè)基因 (ADIPOQ, ADIPOQR1、ADIPOQR2, PPAR-alpha、PCK1、PCK2、G6PC, ACC2、GLUT1、GLUT4、CPT-1、RXRA、RXRB、RXRG) 的 25 個(gè) SNP (rs266729、rs16861205、rsl342387、rs12733285、rs767870、rs1044471、rs4823613、 rs5767743、rs1042531、rs11908628、rs2301336、rs4982856、rs2593595、rs2268388、 rs3754219、rs12718444、rs5435、rsl6956647、rs11228368、rs11185660、rs1045570. rs2744537、rs2076310、rs1467664、rs3753898)進(jìn)行分型。將核查后的問卷信息、體格檢查及臨床生化檢查結(jié)果與SNP數(shù)據(jù)整合,用于統(tǒng)計(jì)分析。受試者的基本信息及生理生化指標(biāo)等采用t檢驗(yàn)或者卡方檢驗(yàn)進(jìn)行比較；單個(gè)SNP與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)分析采用Pearson卡方檢驗(yàn)、Cochran-Armitage趨勢檢驗(yàn)、MAX3、logistic回歸等方法；LD block內(nèi)的單倍型分析采用非條件Logistic回歸分析;SNP-SNP互作分析也采用logistic回歸模型；通路分析采用基于logistic kernel machine regression的SNP集分析方法。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析由SPSS15.0. PLINK1.07、R2.14.2、Haploview4.2、SNPstats等統(tǒng)計(jì)軟件包完成。結(jié)果：(1)LEP通路與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果：單位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析中,rs2167270在未調(diào)整協(xié)變量和調(diào)整協(xié)變量顯性模型下均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,在未調(diào)整協(xié)變量和調(diào)整協(xié)變量共顯性模型下,基因型AG相對于基因型GG均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,在未調(diào)整協(xié)變量超顯性模型下有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但在調(diào)整協(xié)變量超顯性模型下無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；rs16147在穩(wěn)健檢驗(yàn)、隱形模型、超顯性模型下調(diào)整協(xié)變量前和調(diào)整協(xié)變量后均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn),我們所檢測LEP基因的rs2167270和rs4731426、JAK1基因的rs10889502和rs17127107、PPARGC1A基因的rs2970847和rs6821591、PRKAA1基因的rs249429和rs3805486、PRKAA2基因的rs1342382和rs6588640、PRKAB2基因的rs3766522和rs6937、PRKAG2基因的rs2970847和rs6821591、PRKAG3基因的rs6436094和rs645163等8個(gè)基因內(nèi)的各自2個(gè)位點(diǎn)之間存在連鎖不平衡關(guān)系；非條件Logistic回歸分析未發(fā)現(xiàn)各基因內(nèi)LDblock的單倍型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的陽性結(jié)果。LEP通路與ADIPO通路兩條通路下的29個(gè)基因48個(gè)SNP互作分析得到15對有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果,它們對應(yīng)的基因分別為：SLC2A1與LEP, PRKAA2與PCK2, PRKAA2與G6PC, JAK1與PRKAG3, RXRG與NPY, PRKAG3與DDN, PPARGC1A與LEP, PPARGC1A與PCK2,PRKAA1與PPARA, PRKAA1與PPARA, NPY與ADIPOR2, LEP與SLC2A4, LEP與SLC2A4, LEP與PCK1, STAT3與PCKl,其中LEP、JAK1、STAT3、PPARGC1A、PRKAA1、PRKAA2、 PRKAG1、PRKAG3、NPY等9個(gè)基因存在于LEP通路中,其余8個(gè)基因存在于ADIPO通路中,LEP通路中僅有2對有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的SNP-SNP互作;LEP、 PRKAA2、PCK2、PRKAG3、NPY、PPARGCIA、PCK1與其他基因存在較多的互作,尤其是與LEP存在互作的基因多達(dá)4個(gè),提示這些基因在糖脂代謝中可能具有比較重要的作用,LEP可能存在較為關(guān)鍵的作用；此外PRKAA1與PPARA、LEP與SLC2A4的4個(gè)SNP分別存在2對有意義的互作,提示PRKAA1與PPARA、LEP與SLC2A4之間可能有比較緊密的關(guān)系；rs16147和rs2167270均被包含在內(nèi),可看作rs16147和rs2167270與2型糖尿病關(guān)聯(lián)的另一個(gè)證據(jù)。無論是否加入?yún)f(xié)變量,LEP通路與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)ADIPO通路與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果：單位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析中,rs3753898在等位基因關(guān)聯(lián)分析、基因型關(guān)聯(lián)分析、穩(wěn)健檢驗(yàn)及調(diào)整協(xié)變量后均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,得到了穩(wěn)定一致的結(jié)果；rs1042531在未調(diào)整協(xié)變量和調(diào)整協(xié)變量超顯性模型下均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,在調(diào)整協(xié)變量共顯性模型下,基因型TG相對于基因型TT有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,基因型GG相對于基因型GG無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；rs12718444在未調(diào)整協(xié)變量和調(diào)整協(xié)變量隱形模型下均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,在調(diào)整協(xié)變量共顯性模型下,基因型TG相對于基因型GG無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,基因型TT相對于基因型GG有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；rs1044471在未調(diào)整協(xié)變量的超顯性遺傳模型下有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但是調(diào)整協(xié)變量后兩者均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明它們可能受到協(xié)變量的影響。連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn),我們所檢測ADIPOQ基因的rs16861205和rs266729、ADIPOR1基因rsl2733285和rs1342387、ADIPOR2基因的rs1044471和rs767870、PPARA基因的rs4823613和rs5767743、PCK1的rs1042531和rs11908628、PCK2基因的rs2301336和rs4982856、SLC2A1基因的rs12718444和rs3754219、SLC2A4基因的rs16956647和rs5435、RXRB基因的rs2076310和rs2744537、RXRG基因的rsl467664和rs3753898等10個(gè)基因內(nèi)的各自2個(gè)位點(diǎn)之間均存在連鎖不平衡關(guān)系；非條件Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)RXRG基因內(nèi)rs1467664的等位基因T與rs3753898的等位基因A構(gòu)成的單倍型是2型糖尿病發(fā)生的高危因素,提示對于中國漢族人群來說,RXRG基因的遺傳變異可能是引起糖尿病發(fā)生的遺傳因素；此外,可看作rs3753898與2型糖尿病關(guān)聯(lián)的另一個(gè)證據(jù)。ADIPO通路中基因14個(gè)基因25個(gè)SNP進(jìn)行SNP-SNP互作分析,未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的SNP-SNP互作。但在LEP通路中基因與ADIPO通路中基因SNP-SNP聯(lián)合互作分析中,ADIPO通路中的ADIPOQR2、PPARA、PCK1、PCK2、 G6PC、GLUT1、GLUT4、RXRG等8個(gè)基因與LEP通路下的基因存在SNP-SNP互作關(guān)系,該通路的基因可能與LEP通路中的基因共同發(fā)揮作用；其中rs1042531被包含在互作中,可看作rs1042531與2型糖尿病關(guān)聯(lián)的另一個(gè)證據(jù)。無論是否加入?yún)f(xié)變量,ADIPO通路與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：(1)LEP通路中的rs2167270和rs16147與2型糖尿病存在關(guān)聯(lián)；ADIPO通路中的rs3753898、rs1042531、rsl2718444與2型糖尿病存在關(guān)聯(lián)。(2) ADIPO通路中RXRG基因內(nèi)rs1467664的等位基因T與rs3753898的等位基因A構(gòu)成的單倍型是2型糖尿病發(fā)生的高危因素。(3)LEP通路與ADIPO通路兩條通路下基因中的SNP存在多對有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的互作,SNP-SNP互作可以增加患2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn),是2型糖尿病遺傳結(jié)構(gòu)的組成部分。(4)根據(jù)logistic kernel machine regression結(jié)果,尚不能認(rèn)為LEP通路及ADIPO通路與2型糖尿病存在關(guān)聯(lián)。
【關(guān)鍵詞】：2型糖尿病 遺傳流行病學(xué) SNP-SNP互作 通路分析
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R587.1
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-22
• 第1章 緒言22-32
• 1.1 研究背景22-29
• 1.2 研究目的及意義29-31
• 1.3 研究思路31-32
• 第2章 資料的收集整理與分析32-55
• 2.1 研究對象32
• 2.2 資料收集與血樣采集32-33
• 2.3 資料整理與數(shù)據(jù)庫的建立33
• 2.4 DNA提取33-35
• 2.4.1 主要試劑及來源33-34
• 2.4.2 主要實(shí)驗(yàn)器材及來源34
• 2.4.3 基因組DNA提取步驟34-35
• 2.5 SNP篩選與分型35-42
• 2.5.1 主要試劑及來源38
• 2.5.2 主要實(shí)驗(yàn)器材及來源38-39
• 2.5.3 SNP分型原理及操作步驟39-42
• 2.6 質(zhì)量控制42
• 2.6.1 數(shù)據(jù)收集過程中的質(zhì)量控制42
• 2.6.2 SNP分型的質(zhì)量控制42
• 2.7 統(tǒng)計(jì)分析方法及其相關(guān)統(tǒng)計(jì)軟件包42-55
• 2.7.1 病例組與對照組基線資料的均衡性檢驗(yàn)42-43
• 2.7.2 單個(gè)SNP與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)分析43-50
• 2.7.3 連鎖不平衡分析和基于單倍型的關(guān)聯(lián)分析50-51
• 2.7.4 SNP-SNP互作分析51
• 2.7.5 通路分析51-55
• 第3章 LEP通路與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)分析55-80
• 3.1 前言55-56
• 3.2 結(jié)果56-73
• 3.2.1 病例組與對照組基線資料的均衡性檢驗(yàn)結(jié)果56
• 3.2.2 SNP分型結(jié)果56-57
• 3.2.3 等位基因關(guān)聯(lián)分析結(jié)果57
• 3.2.4 基因型關(guān)聯(lián)分析結(jié)果57-66
• 3.2.5 連鎖不平衡分析和基于單倍型的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果66-71
• 3.2.6 SNP-SNP互作結(jié)果71-73
• 3.2.7 通路分析結(jié)果73
• 3.3 討論73-78
• 3.3.1 單位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析74-75
• 3.3.2 連鎖不平衡分析和基于單倍型的關(guān)聯(lián)分析75
• 3.3.3 SNP-SNP互作分析75-78
• 3.3.4 通路分析78
• 3.4 小結(jié)78-80
• 第4章 ADIPO通路與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)分析80-107
• 4.1 前言80-81
• 4.2 結(jié)果81-102
• 4.2.1 SNP分型結(jié)果81
• 4.2.2 等位基因關(guān)聯(lián)分析結(jié)果81-85
• 4.2.3 基因型關(guān)聯(lián)分析結(jié)果85-93
• 4.2.4 連鎖不平衡分析和基于單倍型的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果93-101
• 4.2.5 SNP-SNP互作結(jié)果101
• 4.2.6 通路分析結(jié)果101-102
• 4.3 討論102-106
• 4.3.1 單位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析102-104
• 4.3.2 連鎖不平衡分析和基于單倍型的關(guān)聯(lián)分析104-105
• 4.3.3 SNP-SNP互作分析105
• 4.3.4 通路分析105-106
• 4.4 小結(jié)106-107
• 第5章 總結(jié)107-111
• 5.1 主要結(jié)果與結(jié)論107-109
• 5.1.1 主要結(jié)果107-109
• 5.1.2 結(jié)論109
• 5.2 特色與優(yōu)勢109-110
• 5.3 不足之處110
• 5.4 研究展望110-111
• 參考文獻(xiàn)111-125
• 附錄1 縮寫詞中英文對照125-128
• 附錄2128-131
• 攻讀學(xué)位期間成果131-132
• 致謝132-134

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本文編號：720301