本文關(guān)鍵詞：IL-37b基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對DSS誘導(dǎo)的腸炎緩解作用的研究

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【摘要】：目的白介素37b(IL-37b)具有顯著的免疫抑制功能,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)對炎癥性腸病具有緩解作用并且是理想的外源基因表達(dá)載體。本研究的目標(biāo)是觀察IL-37b基因修飾的小鼠MSC對葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的炎癥性腸病小鼠模型的緩解效果并探討發(fā)揮作用的機(jī)制。方法實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)和免疫組化檢測潰瘍性結(jié)腸炎病人的病變腸組織中IL-37基因的m RNA和蛋白表達(dá)情況。構(gòu)建表達(dá)IL-37b基因的腺病毒載體。C57BL/6小鼠致密骨片中分離培養(yǎng)MSC,流式細(xì)胞儀鑒定MSC表面標(biāo)記分子,油紅O和von Kossa染色鑒定MSC成脂成骨分化潛能。攜帶IL-37b基因的腺病毒轉(zhuǎn)染MSC后RT-PCR、western blot和ELISA鑒定IL-37b在MSC中的表達(dá)。C57BL/6小鼠飲用3%DSS連續(xù)8天,制備炎癥性腸病小鼠模型。在給于3%DSS的第一天,將小鼠隨機(jī)分為MSC-IL37b組(腹腔注射轉(zhuǎn)染IL-37b基因的MSC),MSC-e GFP組(腹腔注射轉(zhuǎn)染對照病毒的MSC),MSC組(腹腔注射未轉(zhuǎn)染病毒的MSC)和PBS組(腹腔注射PBS)。每日記錄小鼠體重和大便情況,第10天處死小鼠,取結(jié)腸,測量結(jié)腸長度,HE評估結(jié)腸炎癥嚴(yán)重程度;取小鼠脾臟,流式細(xì)胞儀分析脾臟單個(gè)核細(xì)胞中髓系來源抑制性細(xì)胞(MDSCs,CD11b+Gr1+)和CD4+T細(xì)胞中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs,CD4+CD25+Foxp3+)比例,細(xì)胞內(nèi)因子染色(ICS)分析CD4+和CD8+T細(xì)胞炎癥因子表達(dá)情況。結(jié)果IL-37基因在潰瘍性結(jié)腸炎病人的病變組織中表達(dá)明顯增高,且其蛋白表達(dá)水平隨炎癥程度的增加而增加,提示其參與了整個(gè)疾病進(jìn)展過程。培養(yǎng)至P3時(shí)超過95%細(xì)胞表達(dá)典型的MSC表面標(biāo)記分子,且能成功分化為成脂和成骨細(xì)胞。IL-37b基因修飾的MSC分泌性表達(dá)IL-37b蛋白(13.03±1.023 ng/ml)。第10天處死小鼠,結(jié)果顯示:MSC-IL37b組的體重減少程度顯著低于PBS組(85.74±2.01%vs.73.85±2.18%,P0.05),PBS組與MSC組或MSC-e GFP組相比,體重減少趨勢更明顯,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(73.85±2.18%vs.80.36±2.28%P=0.07;73.85±2.18%vs.77.38±2.21%,P=0.28);MSC-IL37b組(5.733±0.1706 cm)的平均結(jié)腸長度顯著高于PBS組(4.375±0.2287 cm,P0.001)、MSC組(5.117±0.1078 cm,P0.05)和MSC-e GFP組(4.967±0.1333 cm,P0.01),MSC組或MSC-e GFP組的結(jié)腸長度都顯著高于PBS組(P0.01,P0.05);病變腸組織的炎癥評分MSC-IL37b組(2.9±0.2449)顯著低于PBS組(5±0.4,P0.01)、MSC組(3.9±0.3317,P0.05)和MSC-e GFP組(4.2±0.3742,P0.05),MSC組顯著低于PBS組(P0.05),MSC-e GFP組有低于PBS組的趨勢,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.0639);在第10天實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),MSC-IL37b組、MSC組和MSC-e GFP組無小鼠死亡,而PBS組的死亡率可達(dá)到66.7%,顯著高于其它各組;脾臟CD4+T細(xì)胞中Tregs的比例MSC-IL37b組(18.95±0.9919%)顯著高于MSC-e GFP組,(12.53±0.6977%,P0.001)、MSC組(13.89±0.7742%,P0.01)和PBS組(10.10±0.8365%,P0.0001),MSC組顯著高于PBS組(P0.05),但MSC-e GFP組和PBS組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;脾臟單個(gè)核細(xì)胞中MDSCs的比例MSC-IL37b組(4.843±0.1648%)顯著高于PBS組(2.693±0.4248%,P0.01)和MSC-e GFP(3.103±0.2551%,P0.05),但與MSC組(3.643±0.3143%,P=0.112)之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;細(xì)胞內(nèi)因子染色結(jié)果顯示具有誘導(dǎo)Tregs分化功能的抑炎因子IL-2在CD4+T細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯上調(diào),而促炎因子IFN-γ在CD4+和CD8+T細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯上調(diào)。結(jié)論IL-37b可能作為重要的抑炎因子參與了潰瘍性結(jié)腸炎的疾病進(jìn)展過程。IL-37b基因修飾的MSC能明顯緩解DSS誘導(dǎo)的腸炎小鼠模型的炎癥嚴(yán)重程度,其緩解作用優(yōu)于未進(jìn)行基因修飾的MSC,其機(jī)制可能是通過促進(jìn)Treg和MDSC細(xì)胞分化以及下調(diào)IFN-γ的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。目的:除免疫抑制功能外,有文獻(xiàn)報(bào)道IL-37b具有抗癌作用,但其潛在機(jī)制還不十分明確。在本研究中,我們探索了IL-37b基因轉(zhuǎn)染對4T1乳腺癌生長的影響以及其機(jī)制。方法:將IL-37b腺病毒表達(dá)載體Ad-IL37b轉(zhuǎn)染小鼠乳腺癌細(xì)胞系4T1(轉(zhuǎn)染IL-37b基因的細(xì)胞命名為4T1-IL37b)。通過ELISA檢測4T1-IL37b是否分泌性表達(dá)IL-37b蛋白。通過體外細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)明確IL-37b基因表達(dá)是否影響4T1細(xì)胞生長。將4T1-IL37b細(xì)胞或?qū)⑽崔D(zhuǎn)染IL-37b基因的4T1細(xì)胞與絲裂霉素處理的4T1-IL37b細(xì)胞(生長停滯,不具備成瘤性)注射至BALB/c小鼠皮下,評估腫瘤生長速度和小鼠存活率。通過CFSE實(shí)驗(yàn)檢測IL-37b重組蛋白對T細(xì)胞體外增殖的影響。將4T1-IL37b細(xì)胞注射至BALB/c裸鼠和NOD-SCID小鼠,評估腫瘤的生長速度和小鼠的存活率。結(jié)果:病毒轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,4T1-IL37b上清中能檢測到12.2±0.684 ng/ml的IL-37b蛋白。IL-37b基因的表達(dá)不影響4T1細(xì)胞的增殖速度。與不表達(dá)IL-37b基因的4T1或4T1-相比,4T1-IL37b在正常BALB/c小鼠體內(nèi)的腫瘤生長速度明顯更緩慢。未轉(zhuǎn)染IL-37b基因的4T1細(xì)胞與絲裂霉素處理的4T1-IL37b細(xì)胞共注射組腫瘤的生長速度也明顯減緩。IL-37b重組蛋白對CD4+T細(xì)胞顯示直接激活作用,但對CD8+T細(xì)胞未顯示激活作用。IL-37b基因轉(zhuǎn)染在BALB/c裸鼠和NOD-SCID小鼠體內(nèi)未顯示抗腫瘤作用。結(jié)論:IL-37b基因通過作用于腫瘤微環(huán)境進(jìn)而影響T細(xì)胞活化起到抗4T1乳腺癌的作用。
【關(guān)鍵詞】：白介素37b 腸炎 間充質(zhì)干細(xì)胞 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 髓系來源抑制性細(xì)胞 人白介素37b 乳腺癌 抗腫瘤作用 CD4+T細(xì)胞 腫瘤微環(huán)境
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R574.62
【目錄】：

• PARTⅠ IL-37b基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對DSS誘導(dǎo)的腸炎緩解作用的研究4-73
• 中文摘要4-6
• Abstract6-8
• 縮略語/符號說明8-15
• 前言15-23
• 研究現(xiàn)狀、成果15-20
• 研究目的、方法20-23
• 一、IL-37在人潰瘍性結(jié)腸炎(UC)病變組織中的表達(dá)23-29
• 1.1 對象和方法23-26
• 1.1.1 人UC標(biāo)本的收集23
• 1.1.2 UC病理組織學(xué)分級標(biāo)準(zhǔn)23
• 1.1.3 活檢組織總RNA提取23-24
• 1.1.4 樣本c DNA的制備24
• 1.1.5 Real-time PCR24-25
• 1.1.6 免疫組化（SABC法）25-26
• 1.2 結(jié)果26-28
• 1.2.1 IL-37 m RNA表達(dá)水平在人活動(dòng)性潰瘍性結(jié)腸炎組織中的表達(dá)水平顯著高于正常組織26-27
• 1.2.2 IL-37b蛋白表達(dá)水平與人活動(dòng)性潰瘍性結(jié)腸炎的病理分級呈正相關(guān)27-28
• 1.3 討論28
• 1.4 小結(jié)28-29
• 二、IL-37b腺病毒表達(dá)載體（Ad-IL37b）的構(gòu)建29-35
• 2.1 對象和方法29-32
• 2.1.1 IL-37b腺病毒包裝質(zhì)粒的構(gòu)建29-30
• 2.1.2 腺病毒的包裝30
• 2.1.3 腺病毒的大量擴(kuò)增和收集30-31
• 2.1.4 病毒滴度檢測31-32
• 2.2 結(jié)果32-34
• 2.2.1 IL-37b基因的c DNA序列成功連接入腺病毒包裝質(zhì)粒32-33
• 2.2.2 腺病毒包裝和擴(kuò)增過程中出現(xiàn)的細(xì)胞病變斑33
• 2.2.3 腺病的滴度測定結(jié)果33-34
• 2.3 討論34
• 2.4 小結(jié)34-35
• 三、小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的分離培養(yǎng)和鑒定35-43
• 3.1 對象和方法35-38
• 3.1.1 小鼠骨髓MSCs的分離35-36
• 3.1.2 小鼠骨髓MSCs的傳代培養(yǎng)與擴(kuò)增36
• 3.1.3 小鼠骨髓MSCs的凍存36
• 3.1.4 小鼠骨髓MSCs的復(fù)蘇36-37
• 3.1.5 小鼠骨髓MSCs的免疫表型鑒定37
• 3.1.6 小鼠骨髓MSCs的多系分化潛能鑒定37-38
• 3.2 結(jié)果38-41
• 3.2.1 小鼠骨髓MSCs的貼壁培養(yǎng)38-39
• 3.2.2 小鼠骨髓MSCs的免疫表型39-40
• 3.2.3 小鼠骨髓MSCs的成脂、成骨分化40-41
• 3.3 討論41-42
• 3.4 小結(jié)42-43
• 四、Ad-IL37b轉(zhuǎn)染MSCs以及IL-37b基因在MSCs中的表達(dá)43-50
• 4.1 對象和方法43-48
• 4.1.1 腺病毒轉(zhuǎn)染43
• 4.1.2 細(xì)胞總RNA的提取及IL-37b m RNA表達(dá)水平的檢測43
• 4.1.3 細(xì)胞總蛋白的提取和定量43-44
• 4.1.4 Western blot檢測IL-37b的蛋白表達(dá)水平44-47
• 4.1.5 流式細(xì)胞儀檢測病毒轉(zhuǎn)染效率47
• 4.1.6 ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-37b蛋白濃度47-48
• 4.1.7 本部分研究的流程圖48
• 4.2 結(jié)果48-49
• 4.2.1 腺病毒Ad-IL37b感染MSCs的效率48-49
• 4.2.2 IL-37b在MSC-IL37b中的表達(dá)49
• 4.3 討論49
• 4.4 小結(jié)49-50
• 五、MSC-IL37b對DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性腸炎的緩解作用50-64
• 5.1 對象和方法50-53
• 5.1.1 小鼠DSS腸炎模型的構(gòu)建50
• 5.1.2 DSS小鼠腸炎模型干預(yù)效果評估50
• 5.1.3 小鼠腸炎病理組織學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)50-51
• 5.1.4 小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞的提取51
• 5.1.5 小鼠脾臟調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分析51
• 5.1.6 小鼠脾臟髓系來源的抑制性細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分析51-52
• 5.1.7 小鼠脾臟來源的CD4+和CD8+細(xì)胞內(nèi)因子染色的流式細(xì)胞儀檢測52
• 5.1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法52-53
• 5.2 結(jié)果53-59
• 5.2.1 不同干預(yù)腸炎小鼠的體重變化情況53
• 5.2.2 不同干預(yù)腸炎小鼠的生存率比較53-54
• 5.2.3 不同干預(yù)腸炎小鼠的結(jié)腸長度比較54-55
• 5.2.4 不同干預(yù)腸炎小鼠的結(jié)腸炎癥組織學(xué)評分55-56
• 5.2.5 不同干預(yù)腸炎小鼠脾臟CD4+ T細(xì)胞中Treg所占比例的比較56-57
• 5.2.6 不同干預(yù)腸炎小鼠脾臟髓系來源的抑制性細(xì)胞含量的比較57-58
• 5.2.7 不同干預(yù)腸炎小鼠脾臟T中細(xì)胞內(nèi)因子表達(dá)情況比較58-59
• 5.3 討論59-63
• 5.4 小結(jié)63-64
• PARTⅠ全文結(jié)論64-65
• PARTⅠ論文創(chuàng)新點(diǎn)65-66
• PARTⅠ參考文獻(xiàn)66-73
• PART Ⅱ IL-37b基因轉(zhuǎn)染對 4T1小鼠乳腺癌生長速度影響的研究73-91
• 中文摘要73-74
• Abstract74-75
• 前言75-76
• 研究現(xiàn)狀、成果75
• 研究目的、方法75-76
• 1.對象和方法76-80
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)細(xì)胞76
• 1.2 4T1小鼠乳腺癌細(xì)胞的培養(yǎng)76
• 1.3 4T1細(xì)胞系的凍存與復(fù)蘇76
• 1.4 小鼠淋巴結(jié)T細(xì)胞的分離76-77
• 1.5 免疫磁珠分選法分離CD4+ T細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞77-78
• 1.6 IL-37b重組蛋白對T細(xì)胞體外活化和增殖的影響78-79
• 1.7 Ad-IL37b重組腺病毒轉(zhuǎn)染 4T1小鼠乳腺癌細(xì)胞79
• 1.8 IL-37b基因在 4T1-IL37b細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的檢測79
• 1.9 IL-37b基因轉(zhuǎn)染對 4T1增殖能力的影響79
• 1.10 絲裂霉素C處理 4T1-IL37b或 4T1-e GFP細(xì)胞79
• 1.11 小鼠成瘤實(shí)驗(yàn)79-80
• 1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法80
• 2.結(jié)果80-84
• 2.1 IL-37b基因在 4T1-IL37b細(xì)胞中的表達(dá)及對癌細(xì)胞增殖的影響80-81
• 2.2 4T1、4T1-e GFP 和 4T1-IL37b 在 BALB/c 小鼠體內(nèi)腫瘤生長速度的比較81-82
• 2.3 絲裂霉素C處理的 4T1-IL37b細(xì)胞對 4T1腫瘤生長的影響82-83
• 2.4 重組IL-37b蛋白對T細(xì)胞體外增殖的影響83
• 2.5 4T1-IL37b在BALB/c裸鼠和NOD/SCID小鼠體內(nèi)的腫瘤生長情況83-84
• 3.討論84-87
• PARTⅡ全文結(jié)論87
• PARTⅡ論文創(chuàng)新點(diǎn)87-88
• PARTⅡ參考文獻(xiàn)88-91
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明91-93
• 附錄93-98
• 一、主要儀器93-94
• 二、主要試劑94-96
• 三、主要溶液配制96-98
• 綜述98-115
• 綜述參考文獻(xiàn)109-115
• 致謝115

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：700930