本文關鍵詞：IL-37b基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞對DSS誘導的腸炎緩解作用的研究

  更多相關文章： 白介素37b 腸炎 間充質(zhì)干細胞 調(diào)節(jié)性T細胞 髓系來源抑制性細胞 人白介素37b 乳腺癌 抗腫瘤作用 CD4+T細胞 腫瘤微環(huán)境

【摘要】：目的白介素37b(IL-37b)具有顯著的免疫抑制功能,骨髓間充質(zhì)干細胞(MSC)對炎癥性腸病具有緩解作用并且是理想的外源基因表達載體。本研究的目標是觀察IL-37b基因修飾的小鼠MSC對葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的炎癥性腸病小鼠模型的緩解效果并探討發(fā)揮作用的機制。方法實時熒光定量PCR(RT-PCR)和免疫組化檢測潰瘍性結腸炎病人的病變腸組織中IL-37基因的m RNA和蛋白表達情況。構建表達IL-37b基因的腺病毒載體。C57BL/6小鼠致密骨片中分離培養(yǎng)MSC,流式細胞儀鑒定MSC表面標記分子,油紅O和von Kossa染色鑒定MSC成脂成骨分化潛能。攜帶IL-37b基因的腺病毒轉染MSC后RT-PCR、western blot和ELISA鑒定IL-37b在MSC中的表達。C57BL/6小鼠飲用3%DSS連續(xù)8天,制備炎癥性腸病小鼠模型。在給于3%DSS的第一天,將小鼠隨機分為MSC-IL37b組(腹腔注射轉染IL-37b基因的MSC),MSC-e GFP組(腹腔注射轉染對照病毒的MSC),MSC組(腹腔注射未轉染病毒的MSC)和PBS組(腹腔注射PBS)。每日記錄小鼠體重和大便情況,第10天處死小鼠,取結腸,測量結腸長度,HE評估結腸炎癥嚴重程度;取小鼠脾臟,流式細胞儀分析脾臟單個核細胞中髓系來源抑制性細胞(MDSCs,CD11b+Gr1+)和CD4+T細胞中調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs,CD4+CD25+Foxp3+)比例,細胞內(nèi)因子染色(ICS)分析CD4+和CD8+T細胞炎癥因子表達情況。結果IL-37基因在潰瘍性結腸炎病人的病變組織中表達明顯增高,且其蛋白表達水平隨炎癥程度的增加而增加,提示其參與了整個疾病進展過程。培養(yǎng)至P3時超過95%細胞表達典型的MSC表面標記分子,且能成功分化為成脂和成骨細胞。IL-37b基因修飾的MSC分泌性表達IL-37b蛋白(13.03±1.023 ng/ml)。第10天處死小鼠,結果顯示:MSC-IL37b組的體重減少程度顯著低于PBS組(85.74±2.01%vs.73.85±2.18%,P0.05),PBS組與MSC組或MSC-e GFP組相比,體重減少趨勢更明顯,但無統(tǒng)計學差異(73.85±2.18%vs.80.36±2.28%P=0.07;73.85±2.18%vs.77.38±2.21%,P=0.28);MSC-IL37b組(5.733±0.1706 cm)的平均結腸長度顯著高于PBS組(4.375±0.2287 cm,P0.001)、MSC組(5.117±0.1078 cm,P0.05)和MSC-e GFP組(4.967±0.1333 cm,P0.01),MSC組或MSC-e GFP組的結腸長度都顯著高于PBS組(P0.01,P0.05);病變腸組織的炎癥評分MSC-IL37b組(2.9±0.2449)顯著低于PBS組(5±0.4,P0.01)、MSC組(3.9±0.3317,P0.05)和MSC-e GFP組(4.2±0.3742,P0.05),MSC組顯著低于PBS組(P0.05),MSC-e GFP組有低于PBS組的趨勢,但無統(tǒng)計學差異(P=0.0639);在第10天實驗結束時,MSC-IL37b組、MSC組和MSC-e GFP組無小鼠死亡,而PBS組的死亡率可達到66.7%,顯著高于其它各組;脾臟CD4+T細胞中Tregs的比例MSC-IL37b組(18.95±0.9919%)顯著高于MSC-e GFP組,(12.53±0.6977%,P0.001)、MSC組(13.89±0.7742%,P0.01)和PBS組(10.10±0.8365%,P0.0001),MSC組顯著高于PBS組(P0.05),但MSC-e GFP組和PBS組之間的差異無統(tǒng)計學意義;脾臟單個核細胞中MDSCs的比例MSC-IL37b組(4.843±0.1648%)顯著高于PBS組(2.693±0.4248%,P0.01)和MSC-e GFP(3.103±0.2551%,P0.05),但與MSC組(3.643±0.3143%,P=0.112)之間的差異無統(tǒng)計學意義;細胞內(nèi)因子染色結果顯示具有誘導Tregs分化功能的抑炎因子IL-2在CD4+T細胞中的表達水平明顯上調(diào),而促炎因子IFN-γ在CD4+和CD8+T細胞中的表達水平明顯上調(diào)。結論IL-37b可能作為重要的抑炎因子參與了潰瘍性結腸炎的疾病進展過程。IL-37b基因修飾的MSC能明顯緩解DSS誘導的腸炎小鼠模型的炎癥嚴重程度,其緩解作用優(yōu)于未進行基因修飾的MSC,其機制可能是通過促進Treg和MDSC細胞分化以及下調(diào)IFN-γ的表達實現(xiàn)的。目的:除免疫抑制功能外,有文獻報道IL-37b具有抗癌作用,但其潛在機制還不十分明確。在本研究中,我們探索了IL-37b基因轉染對4T1乳腺癌生長的影響以及其機制。方法:將IL-37b腺病毒表達載體Ad-IL37b轉染小鼠乳腺癌細胞系4T1(轉染IL-37b基因的細胞命名為4T1-IL37b)。通過ELISA檢測4T1-IL37b是否分泌性表達IL-37b蛋白。通過體外細胞增殖實驗明確IL-37b基因表達是否影響4T1細胞生長。將4T1-IL37b細胞或?qū)⑽崔D染IL-37b基因的4T1細胞與絲裂霉素處理的4T1-IL37b細胞(生長停滯,不具備成瘤性)注射至BALB/c小鼠皮下,評估腫瘤生長速度和小鼠存活率。通過CFSE實驗檢測IL-37b重組蛋白對T細胞體外增殖的影響。將4T1-IL37b細胞注射至BALB/c裸鼠和NOD-SCID小鼠,評估腫瘤的生長速度和小鼠的存活率。結果:病毒轉染48小時后,4T1-IL37b上清中能檢測到12.2±0.684 ng/ml的IL-37b蛋白。IL-37b基因的表達不影響4T1細胞的增殖速度。與不表達IL-37b基因的4T1或4T1-相比,4T1-IL37b在正常BALB/c小鼠體內(nèi)的腫瘤生長速度明顯更緩慢。未轉染IL-37b基因的4T1細胞與絲裂霉素處理的4T1-IL37b細胞共注射組腫瘤的生長速度也明顯減緩。IL-37b重組蛋白對CD4+T細胞顯示直接激活作用,但對CD8+T細胞未顯示激活作用。IL-37b基因轉染在BALB/c裸鼠和NOD-SCID小鼠體內(nèi)未顯示抗腫瘤作用。結論:IL-37b基因通過作用于腫瘤微環(huán)境進而影響T細胞活化起到抗4T1乳腺癌的作用。
【關鍵詞】：白介素37b 腸炎 間充質(zhì)干細胞 調(diào)節(jié)性T細胞 髓系來源抑制性細胞 人白介素37b 乳腺癌 抗腫瘤作用 CD4+T細胞 腫瘤微環(huán)境
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R574.62
【目錄】：

• PARTⅠ IL-37b基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞對DSS誘導的腸炎緩解作用的研究4-73
• 中文摘要4-6
• Abstract6-8
• 縮略語/符號說明8-15
• 前言15-23
• 研究現(xiàn)狀、成果15-20
• 研究目的、方法20-23
• 一、IL-37在人潰瘍性結腸炎(UC)病變組織中的表達23-29
• 1.1 對象和方法23-26
• 1.1.1 人UC標本的收集23
• 1.1.2 UC病理組織學分級標準23
• 1.1.3 活檢組織總RNA提取23-24
• 1.1.4 樣本c DNA的制備24
• 1.1.5 Real-time PCR24-25
• 1.1.6 免疫組化（SABC法）25-26
• 1.2 結果26-28
• 1.2.1 IL-37 m RNA表達水平在人活動性潰瘍性結腸炎組織中的表達水平顯著高于正常組織26-27
• 1.2.2 IL-37b蛋白表達水平與人活動性潰瘍性結腸炎的病理分級呈正相關27-28
• 1.3 討論28
• 1.4 小結28-29
• 二、IL-37b腺病毒表達載體（Ad-IL37b）的構建29-35
• 2.1 對象和方法29-32
• 2.1.1 IL-37b腺病毒包裝質(zhì)粒的構建29-30
• 2.1.2 腺病毒的包裝30
• 2.1.3 腺病毒的大量擴增和收集30-31
• 2.1.4 病毒滴度檢測31-32
• 2.2 結果32-34
• 2.2.1 IL-37b基因的c DNA序列成功連接入腺病毒包裝質(zhì)粒32-33
• 2.2.2 腺病毒包裝和擴增過程中出現(xiàn)的細胞病變斑33
• 2.2.3 腺病的滴度測定結果33-34
• 2.3 討論34
• 2.4 小結34-35
• 三、小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）的分離培養(yǎng)和鑒定35-43
• 3.1 對象和方法35-38
• 3.1.1 小鼠骨髓MSCs的分離35-36
• 3.1.2 小鼠骨髓MSCs的傳代培養(yǎng)與擴增36
• 3.1.3 小鼠骨髓MSCs的凍存36
• 3.1.4 小鼠骨髓MSCs的復蘇36-37
• 3.1.5 小鼠骨髓MSCs的免疫表型鑒定37
• 3.1.6 小鼠骨髓MSCs的多系分化潛能鑒定37-38
• 3.2 結果38-41
• 3.2.1 小鼠骨髓MSCs的貼壁培養(yǎng)38-39
• 3.2.2 小鼠骨髓MSCs的免疫表型39-40
• 3.2.3 小鼠骨髓MSCs的成脂、成骨分化40-41
• 3.3 討論41-42
• 3.4 小結42-43
• 四、Ad-IL37b轉染MSCs以及IL-37b基因在MSCs中的表達43-50
• 4.1 對象和方法43-48
• 4.1.1 腺病毒轉染43
• 4.1.2 細胞總RNA的提取及IL-37b m RNA表達水平的檢測43
• 4.1.3 細胞總蛋白的提取和定量43-44
• 4.1.4 Western blot檢測IL-37b的蛋白表達水平44-47
• 4.1.5 流式細胞儀檢測病毒轉染效率47
• 4.1.6 ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清中IL-37b蛋白濃度47-48
• 4.1.7 本部分研究的流程圖48
• 4.2 結果48-49
• 4.2.1 腺病毒Ad-IL37b感染MSCs的效率48-49
• 4.2.2 IL-37b在MSC-IL37b中的表達49
• 4.3 討論49
• 4.4 小結49-50
• 五、MSC-IL37b對DSS誘導的實驗性腸炎的緩解作用50-64
• 5.1 對象和方法50-53
• 5.1.1 小鼠DSS腸炎模型的構建50
• 5.1.2 DSS小鼠腸炎模型干預效果評估50
• 5.1.3 小鼠腸炎病理組織學評分標準50-51
• 5.1.4 小鼠脾臟單個核細胞的提取51
• 5.1.5 小鼠脾臟調(diào)節(jié)性T細胞的流式細胞儀分析51
• 5.1.6 小鼠脾臟髓系來源的抑制性細胞的流式細胞儀分析51-52
• 5.1.7 小鼠脾臟來源的CD4+和CD8+細胞內(nèi)因子染色的流式細胞儀檢測52
• 5.1.8 統(tǒng)計學處理方法52-53
• 5.2 結果53-59
• 5.2.1 不同干預腸炎小鼠的體重變化情況53
• 5.2.2 不同干預腸炎小鼠的生存率比較53-54
• 5.2.3 不同干預腸炎小鼠的結腸長度比較54-55
• 5.2.4 不同干預腸炎小鼠的結腸炎癥組織學評分55-56
• 5.2.5 不同干預腸炎小鼠脾臟CD4+ T細胞中Treg所占比例的比較56-57
• 5.2.6 不同干預腸炎小鼠脾臟髓系來源的抑制性細胞含量的比較57-58
• 5.2.7 不同干預腸炎小鼠脾臟T中細胞內(nèi)因子表達情況比較58-59
• 5.3 討論59-63
• 5.4 小結63-64
• PARTⅠ全文結論64-65
• PARTⅠ論文創(chuàng)新點65-66
• PARTⅠ參考文獻66-73
• PART Ⅱ IL-37b基因轉染對 4T1小鼠乳腺癌生長速度影響的研究73-91
• 中文摘要73-74
• Abstract74-75
• 前言75-76
• 研究現(xiàn)狀、成果75
• 研究目的、方法75-76
• 1.對象和方法76-80
• 1.1 實驗動物及實驗細胞76
• 1.2 4T1小鼠乳腺癌細胞的培養(yǎng)76
• 1.3 4T1細胞系的凍存與復蘇76
• 1.4 小鼠淋巴結T細胞的分離76-77
• 1.5 免疫磁珠分選法分離CD4+ T細胞和CD8+ T細胞77-78
• 1.6 IL-37b重組蛋白對T細胞體外活化和增殖的影響78-79
• 1.7 Ad-IL37b重組腺病毒轉染 4T1小鼠乳腺癌細胞79
• 1.8 IL-37b基因在 4T1-IL37b細胞內(nèi)表達的檢測79
• 1.9 IL-37b基因轉染對 4T1增殖能力的影響79
• 1.10 絲裂霉素C處理 4T1-IL37b或 4T1-e GFP細胞79
• 1.11 小鼠成瘤實驗79-80
• 1.12 統(tǒng)計學處理方法80
• 2.結果80-84
• 2.1 IL-37b基因在 4T1-IL37b細胞中的表達及對癌細胞增殖的影響80-81
• 2.2 4T1、4T1-e GFP 和 4T1-IL37b 在 BALB/c 小鼠體內(nèi)腫瘤生長速度的比較81-82
• 2.3 絲裂霉素C處理的 4T1-IL37b細胞對 4T1腫瘤生長的影響82-83
• 2.4 重組IL-37b蛋白對T細胞體外增殖的影響83
• 2.5 4T1-IL37b在BALB/c裸鼠和NOD/SCID小鼠體內(nèi)的腫瘤生長情況83-84
• 3.討論84-87
• PARTⅡ全文結論87
• PARTⅡ論文創(chuàng)新點87-88
• PARTⅡ參考文獻88-91
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明91-93
• 附錄93-98
• 一、主要儀器93-94
• 二、主要試劑94-96
• 三、主要溶液配制96-98
• 綜述98-115
• 綜述參考文獻109-115
• 致謝115

【共引文獻】

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本文編號：700930