發(fā)布時間：2017-08-17 00:14

  本文關鍵詞：TXNDC5在促進去勢抵抗性前列腺癌發(fā)生中的作用及其機制研究

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【摘要】：前列腺癌(Prostate cancer, PCa)是常見的男性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤。目前為止,雄激素剝奪療法仍是治療進展期PCa的首選方案,雖然起初該治療手段會取得一定效果,但臨床實踐證明在接受該治療12-18個月后,幾乎所有的患者都會轉為去勢抵抗性前列腺癌(Castration resistant prostate cancer, CRPC),死亡率極高。在CRPC的轉變過程中,雄激素受體介導的信號通路會發(fā)生多種改變,其中既包括受體依賴性(AR突變／擴增,腫瘤組織產生雄激素,共調解分子以及AR靶基因的變化),又可以是AR非依賴性的。抑制雄激素合成(比如阿比特龍)和拮抗AR活性(如MDV3100)等藥物的出現(xiàn)在治療CRPC方面取得了很大的進展,但非常遺憾的是,在經過一段時間的治療后,上述藥物在體內都會很快引起耐藥性的出現(xiàn)。因此,CRPC研究的主要目標是：尋找引起CRPC產生的關鍵基因及信號分子,以這些關鍵基因及信號分子為靶點,通過阻斷或抑制前列腺癌細胞中與增殖相關的致病途徑,使細胞不再向去勢抵抗性(雄激素非依賴性)生長的方向轉化,而該目標的實現(xiàn)會為治療CRPC帶來非常大的突破。硫氧還原蛋白是一類在體內廣泛表達的蛋白,可參與調控氧化還原反應。研究表明,與相應的正常組織或良性增生組織相比,該家族的很多成員都在惡性腫瘤組織中過表達,并與腫瘤的增殖以及患者的預后相關。針對該家族成員的抑制劑,比如PX-12和SAHA,都已用于實驗動物模型或臨床初試。硫氧還原蛋白5(Thioredoxin domain-containing protein 5, TXNDC5)屬于其家族一員,具有蛋白折疊和分子伴侶活性。研究發(fā)現(xiàn)TXNDC5在多種惡性腫瘤中都有過表達。有研究提示TXNDC5在長期雄激素剝奪的LNCaP細胞中表達明顯升高,但它在CRPC發(fā)生和發(fā)展中的作用和機制有待于進一步研究。研究目的：1、分析TXNDC5在CRPC轉變過程中的作用；2、研究TXNDC5促進PCa進展的致病機制；3、探討TXNDC5在前列腺癌中的表達調控機制。創(chuàng)新點及意義：1、本研究首次證明TXNDC5可促進CRPC的轉變,并闡明其作用的發(fā)揮依賴于AR信號通路；2、分析了雄激素剝奪治療后誘導的乏氧在促發(fā)CRPC轉變時,TXNDC5可能起到關鍵分子的作用,并明確了miR-200b所介導的乏氧對TXNDC5表達的調控；3、本研究發(fā)現(xiàn)了誘導CRPC轉變的關鍵分子,提示可以研發(fā)針對TXNDC5的抑制劑,用于CRPC的治療和預防。研究方法：1、探討TXNDC5在PCa中的表達特點1.1免疫組織化學法檢測TXNDC5在PCa組織中的表達收集71例局限性激素敏感性PCa組織和23例CRPC組織,免疫組織化學法檢測其表達。1.2體外誘導PCa細胞發(fā)生雄激素非依賴性生長轉變,檢測’TXNDC5的表達變化雄激素剝奪條件培養(yǎng)雄激素敏感性PCa細胞(LNCaP), Western blot法檢測TXNDC5的表達變化。2、研究TXNDC5在PCa細胞中的生物學功能2.1 Western blot檢測針對TXNDC5的小干擾RNA (siRNA)的抑制效率和過表達質粒的表達效率2.2調控TXNDC5表達后對PCa細胞增殖、侵襲和周期的影響沉默TXNDC5的表達,采用MTT、Transwell和流式細胞術等方法檢測對細胞增殖、侵襲和細胞周期的影響；將TXNDC5過表達載體轉染入LNCaP細胞后,G418篩選過表達的穩(wěn)轉細胞系(LNCaP-TXNDC5),采用以上方法檢測其對細胞活性的影響。2.3 TXNDC5對成瘤性的影響分別將LNCaP-TXNDC5和其對照(LNCaP-VC)注入裸鼠腋下,觀察不同時間點對成瘤性的影響。2.4 TXNDC5對前列腺特異性抗原(Prostate specific antigen, PSA)分泌的影響3、研究TXNDC5在CRPC轉變過程中的作用3.1在雄激素剝奪條件下,體內外實驗檢測調控TXNDC5的表達對細胞增殖和成瘤性的影響在雄激素剝奪條件下,MTT法檢測過表達TXNDC5對PCa細胞增殖的影響；將LNCaP-TXNDC5和LNCaP-VC分別接種于裸鼠腋下,對裸鼠行去勢處理,觀察對成瘤性的影響。3.2 TXNDC5對CRPC相關信號通路活性的影響在LNCaP-TXNDC5和LNCaP-VC細胞中,加入雙氫睪酮(DHT)和CoCl2的刺激,Western blot法檢測過表達TXNDC5對LNCaP細胞中Akt、MAPK、Her2和MET等信號通路總蛋白和磷酸化蛋白表達水平的影響。4、鑒定與TXNDC5相互作用的蛋白構建含HA標簽的TXNDC5表達載體,轉染入LNCaP細胞,免疫沉淀法提取細胞中的TXNDC5蛋白及其相互結合蛋白。將樣品進行SDS-PAGE跑膠,取表達差異的膠粒進行質譜鑒定。5、研究TXNDC5功能的發(fā)揮與AR信號通路的關系5.1 TXNDC5調控細胞增殖和侵襲的功能是否依賴于AR信號通路沉默PCa細胞中AR的表達或用Enzalutamide抑制AR的活性,MTT和Transwell法檢測以上處理對LNCaP-TXNDC5細胞增殖和侵襲的影響。5.2 TXNDC5促進癌細胞在裸鼠體內成瘤的功能是否依賴于AR信號通路將LNCaP-TXNDC5和LNCaP-VC細胞注入裸鼠腋下,等到瘤塊體積增長至200mm3時對其進行去勢處理；當血清中的PSA水平超過50ng/mL時,將Enzalutamide和對照注射入小鼠體內,觀察對小鼠成瘤性的影響。6、研究TXNDC5對AR信號通路的調控6.1 TXNDC5對AR表達的調控調控TXNDC5在PCa細胞中的表達,Western blot法檢測對AR表達的影響；放線菌酮處理LNCaP-TXNDC5, Western blot法檢測對AR蛋白穩(wěn)定性的影響；免疫共沉淀法檢測沉默TXNDC5表達對AR與HSP-90結合量的影響。6.2 TXNDC5對AR入核的影響在LNCaP細胞中過表達TXNDC5,同時給予DHT刺激,Western blot法檢測AR在細胞胞漿和胞核中的表達。6.3 TXNDC5對AR活性的影響1) TXNDC5對PSA轉錄活性和表達的調控將AR表達載體和PSA啟動子報告基因載體轉染入HEK293T,報告基因法檢測在有無DHT刺激時PSA啟動子區(qū)的轉錄活性；同時調控上述細胞中TXNDC5的表達,相同方法檢測TXNDC5是否影響PSA的啟動子活性；在LNCaP-VC和LNCaP-TXNDC5中,加入不同濃度的DHT, real-time PCR法檢測對PSA表達量的影響。2) TXNDC5對AR活性的影響在LNCaP-VC和LNCaP-TXNDC5中轉染入PSA啟動子報告基因載體,加入不同濃度的刺激因子(包括雌激素、氟他胺和Enzalutamide),檢測對PSA轉錄活性的影響；在LNCaP-VC和LNCaP-TXNDC5中,加入DHT刺激,real-time PCR法檢測AR靶基因(TMPRSS2、FKP51、KLK2和S100P)的表達情況。3) TXNDC5對Enzalutamide藥效的影響在LNCaP-VC和LNCaP-TXNDC5中轉染入PSA啟動子報告基因載體,同時加入不同濃度Enzalutamide,檢測對PSA轉錄活性的影響。7、研究HSP70對TXNDC5表達和功能的影響7.1 HSP70對TXNDC5功能的影響沉默LNCaP-TXNDC5細胞中HSP70的表達或用KNK474抑制劑干擾其活性后,MTT和Transwell法檢測以上處理對細胞增殖和侵襲能力的影響。7.2 HSP70對TXNDC5表達的調控沉默PCa細胞中HSP70的表達或用KNK474抑制劑干擾其活性后,Western blot法檢測對TXNDC5蛋白表達的影響；干擾PCa細胞中HSP70的表達,同時在細胞中加入放線菌酮,Western blot法檢測對TXNDC5蛋白穩(wěn)定性的影響。8、探討在PCa病變過程中,乏氧對TXNDC5表達和功能的調控8.1 CoCl2誘導的乏氧對TXNDC5表達和活性的影響1)用CoCl2處理PCa細胞,Western blot法檢測TXNDC5的表達變化。2)免疫共沉淀法檢測長期雄激素剝奪以及CoCl2處理對TXNDC5與AR結合量的影響。8.2乏氧是否通過microRNA調控TXNDC5的表達1)沉默HIF-1α表達后檢測TXNDC5的表達；ChIP和報告基因法檢測HIF-1α是否通過結合在TXNDC5的啟動子區(qū)或影響其轉錄活性來調控其表達。2) Real-time PCR法檢測乏氧刺激后,miR-200b在LNCaP, LNCaP-AI和PC3細胞中的表達水平。3)將miR-200b mimic或inhibitor,以及陰性對照轉染入PCa細胞中,Western blot法檢測TXNDC5的表達變化。4)在VCaP和PC3細胞中轉染miR-200b mimic和陰性對照,同時給予細胞CoCl2刺激,Western blot法檢測TXNDC5蛋白的表達變化。5)構建針劉miR-200b靶向TXNDC5 mRNA 3'UTR的熒光素酶報告基因,并同時對miR-200b的結合位點進行突變,將miR-200b mimic/inhibitor和報告基因轉染入HEK293T細胞中,檢鋇miR-200b對TXNDC5 mRNA 3' UTR活性的影響。結果：1、TXNDC5的表達在CRPC轉變過程中明顯上調1.1 TXNDC5主要表達于PCa細胞胞漿；在所檢測的71例局限性激素依賴性PCa中,有65.5%的病例顯示陰性或弱陽性,而只有35.5%顯示中等或強陽性；在CRPC組織中,69.6%的病例呈中等或強陽性,而30.4%是陰性或弱陽性。也就是說,TXNDC5在CRPC組織中高表達的頻度明顯高于局限性激素依賴性PCa(Pearson's=0.672, P=0.017)。1.2長期雄激素剝奪誘導LNCaP發(fā)生雄激素非依賴性生長轉變后,TXNDC5在mRNA和蛋白水平上的表達量均明顯升高。2、2TXNDC5與PCa細胞的異常增殖和侵襲相關2.1通過Western blot法檢測,選擇了2條干擾效率較高的siRNA用于后續(xù)實驗；轉染表達質粒進入LNCaP細胞后,TXNDC5的表達量明顯升高。2.2體外實驗證明,沉默VCaP, LNCaP, DU145和PC3中TXNDC5的表達后,可顯著抑制細胞的增殖和侵襲能力,并可將細胞周期阻滯在S期；而在LNCaP細胞中過表達TXNDC5后,PCa細胞的增殖和侵襲能力均明顯升高。2.3體內實驗證明,將LNCaP-TXNDC5到裸鼠腋下后,細胞的成瘤能力(LNCaP-TXNDC5組瘤塊大�。�2250 mm3)明顯高于對照組(LNCaP-VC組瘤塊大�。�816 mm3)。2.4通過檢測裸鼠血清和細胞培養(yǎng)上清中PSA的表達水平發(fā)現(xiàn),上調或抑制TXNDC5的表達后,PSA的分泌也出現(xiàn)相同趨勢的變化。3、TXNDC5可促進CRPC的發(fā)生和進展3.1雄激素剝奪條件下,在LNCaP細胞中過表達TXNDC5可顯著促進細胞的增殖速率；而在裸鼠去勢條件下,從接種腫瘤細胞的第二周起,NCaP-TXNDC5組的瘤塊明顯大于接種LNCaP-VC的對照組。3.2 LNCaP-TXNDC5細胞一旦接受DHT刺激,Her-2、ERK1/2和Akt信號通路的磷酸化水平都明顯上調,并且升高的幅度顯著高于LNCaP-VC細胞組；而在接受CoCl2刺激時,MET、ERK1/2和Akt信號通路的活性在TXNDC5過表達的細胞中也明顯增高,且被激活的程度明顯高于對照組。4、TXNDC5可與AR和HSP70相互結合在LNCaP細胞中過表達含有標簽蛋白的TXNDC5,免疫共沉淀和質譜技術檢測PCa細胞中與TXNDC5相互結合的蛋白,發(fā)現(xiàn)AR和HSP70蛋白可分別與TXNDC5結合；免疫共沉淀實驗也證實了內源性TXNDC5可分別與AR和HSP70蛋白相互結合。5、TXNDC5通過AR信號通路發(fā)揮作用5.1沉默AR的表達或抑制AR活性后,可顯著抑制’TXNDC5促PCa細胞增殖和侵襲的能力。5.2在小鼠體內注射Enzalutamide后,接種LNCaP-TXNDC5細胞的成瘤速度為19.6 mm3/周,而LNCaP-VC組為168.1 mm3/周。6、TXNDC5可活化AR信號通路6.1 TXNDC5可促進AR的蛋白穩(wěn)定性和入核調控TXNDC5的表達后,對AR在mRNA上的表達水平無明顯影響；而沉默或過表達TXNDC5后,會顯著抑制或上調AR在蛋白水平上的表達量；放線菌酮蛋白酶抑制分析法發(fā)現(xiàn),過表達TXNDC5后,會明顯增加AR的蛋白穩(wěn)定性；免疫共沉淀實驗證明,抑制TXNDC5表達后,會減少AR與HSP-90的結合量。Western blot檢測發(fā)現(xiàn),DHT刺激LNCaP-VC細胞可上調AR在胞核中的表達量(核／質比)；但過表達TXNDC5后,AR蛋白表達的核／質比升高更為明顯。6.2 TXNDC5可活化AR信號通路1) TXNDC5促進PSA的轉錄活性和表達通過報告基因檢測發(fā)現(xiàn),TXNDC5過表達可顯著上調雄激素對PSA啟動子區(qū)轉錄活性的激活作用；real-time PCR檢測結果也證實了以上趨勢,即過表達TXNDC5可顯著增強雄激素對PSA表達量的上調作用。2) TXNDC5活化AR信號通路與DHT刺激相比,氟他胺和Enzalutamide處理會抑制PSA的轉錄活性；但TXNDC5過表達后,會在一定程度上逆轉它們對PSA轉錄活性的抑制作用；在高濃度雌激素刺激下,過表達TXNDC5也可上調其對PSA轉錄活性的激活效應。此外,在過表達TXNDC5的LNCaP細胞中給予雄激素刺激時,可顯著上調AR靶基因(TMPRSS2、FKP51、KLK2和S100P)的表達。3) TXNDC5可影響Enzalutamide的藥效在DHT刺激下,不同濃度的Enzalutamide刺激雖可抑制PSA的轉錄活性,但過表達TXNDC5后可在一定程度上逆轉Enzalutamide對PSA轉錄活性的抑制作用。7、HSP70調控TXNDC5的蛋白穩(wěn)定性7.1在LNCaP-TXNDC5細胞中加入干擾HSP70活性的抑制劑,發(fā)現(xiàn)對PCa細胞的增殖和侵襲無明顯影響。7.2沉默HSP70的表達或抑制其活性后可抑制TXNDC5的表達；放線菌酮蛋白酶抑制分析法檢測發(fā)現(xiàn),沉默HSP70的表達可顯著降低TXNDC5蛋白的半衰期。8、miR-200b介導了乏氧對TXNDC5的表達調控8.1乏氧可上調TXNDC5的表達和活性1) CoCl2誘導的乏氧條件可以上調XNDC5的表達。2)乏氧可上調TXNDC5與AR的相互結合量。8.2乏氧通過miR-200b調控TXNDC5的表達1)干擾HIF-1α在PCa細胞中的表達后,TXNDC5在mRNA和蛋白水平上的表達量均降低；但ChIP法檢測未發(fā)現(xiàn)HIF-1α可結合在TXNDC5的啟動子區(qū)；報告基因法檢測發(fā)現(xiàn)過表達HIF-1α和乏氧刺激對其啟動子區(qū)的活性無明顯調控作用。2) Real-time PCR結果顯示,miR-200b在LNCaP, LNCaP-Al和PC3細胞中的表達依次降低；而加入CoCl2刺激后,miR-200b的表達顯著降低。3)在VCaP和PC3中,轉染入 miR-200b mimic后,TXNDC5的蛋白表達明顯下調；而在LNCaP和RWPE細胞中轉染入miR-200b inhibitor后,TXNDC5的表達明顯上調。4)經過軟件預測分析,發(fā)現(xiàn)miR-200b與TXNDC5的3’-UTR存在相互結合的互補序列,所以我們構建了針對miR-200b結合TXNDC5 3' -UTR序列的野生型和突變型報告質粒。報告基因檢測證實miR-200b可作用于TXNDC5的3’-UTR,從而調控TXNDC5蛋白的表達。5)在PCa細胞中過表達miR-200b后,會顯著抑制CoCl2誘導的乏氧對TXNDC5表達的上調作用。結論：1、TXNDC5可通過AR信號通路促進PCa,特別是CRPC的發(fā)生和發(fā)展；2、TXNDC5可上調AR信號通路的活性；3、乏氧通過miR-200b調控TXNDC5的表達。
【關鍵詞】：硫氧還原蛋白5 雄激素受體 去勢抵抗性前列腺癌 乏氧
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.25
【目錄】：

• 中文摘要6-14
• 英文摘要14-24
• 符號說明24-25
• 前言25-30
• 材料和方法30-56
• 結果56-82
• 討論82-87
• 參考文獻87-93
• 綜述93-104
• 參考文獻101-104
• 致謝104-105
• 攻讀博士學位期間發(fā)表的學術論文目錄105-106
• 承擔課題106-107
• 附件107-135

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1 王林;TXNDC5在促進去勢抵抗性前列腺癌發(fā)生中的作用及其機制研究[D];山東大學;2015年

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本文編號：686217